4-羟基苯乙酸-3-羟化酶A重组表达菌株的构建及其对羟基酪醇的生物 .PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，３５（３）：５６６０ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ ４羟基苯乙酸３羟化酶Ａ重组表达菌株的构建 及其对羟基酪醇的生物转化研究 １ ２ ３ 钱　鑫 　郭红颜 　周庆峰 （１河南农业大学生命科学学院　郑州　４５０００２　２上海医药工业研究院　上海　２０００４０） （３商丘师范学院生命科学学院　商丘　４７６０００） 摘要　目的：构建表达４羟基苯乙酸３羟化酶Ａ（４ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｔｅ３ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅＡ，ＨＨＡ） 的重组菌株，进而以酪醇为底物，利用重组菌株转化生产羟基酪醇。方法：选择大肠杆菌ＢＬ２１ （ＤＥ３）为模板来扩增 ＨＨＡ基因，经酶切后连接到表达载体 ｐＥＴ２８ａ中，获得重组表达载体 ｐＥＴ２８ａＨＨＡ，将重组载体转化到感受态细胞ＢＬ２１（ＤＥ３），在重组菌液中加入适量酪醇，利用胞内 的重组酶对酪醇加羟基合成羟基酪醇，细胞离心后，分别采用薄层层析法和气质联用法检测上清 液中羟基酪醇的转化结果。结果：ＩＰＴＧ诱导表达后，经 ＳＤＳＰＡＧＥ分析获得分子质量分别为 ５８．８ｋＤａ和１８．５ｋＤａ的两条蛋白质条带。薄层层析法和气质联用法均检测到催化产物羟基酪醇 的生成。结论：成功构建了表达ＨＨＡ的重组菌株，该菌株可有效将酪醇转化为羟基酪醇。 关键词　大肠杆菌　酪醇　羟基酪醇　生物转化 中图分类号　Ｑ８１ 　　羟基酪醇（ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ，ＨＴ）化学名为３，４二羟 应，具有成本低、效率高和污染小等诸多优点，广泛应 基苯乙醇，是一种具有强抗氧化活性的天然多酚类化 用于天然化合物的生物合成、药用成分筛选及新药开 合物，主要以酯化物橄榄苦苷的形式存在于橄榄的果 发等领域［７］。４羟基苯乙酸３羟化酶Ａ（ＨＨＡ）就是一 实和枝叶中。橄榄苦苷经水解后得到ＨＴ单体。ＨＴ结 种可以将酪醇进行结构修饰和改造成羟基酪醇的关键 构简单、分子质量小，具有很多有益于人体健康的生物 ［８］ 酶，主要通过羟基化的化学反应进行底物的改造 。 药理活性，因此逐渐受到生物和医学界的重视，成为近 因此，本研究首先从ＢＬ２１（ＤＥ３）中扩增到ＨＨＡ基因序 年来研究的热点［１２］。 列，进一步酶切后连接到ｐＥＴ２８ａ载体中，将获得的重 　　目前，羟基酪醇的获得方法主要包括生物提取法 组表达载体ｐＥＴ２８ａＨＨＡ转化到ＢＬ２１（ＤＥ３）获得重组 和化学合成法。生物提取法主要采用橄榄的各个部位 工程菌，经ＩＰＴＧ诱导表达后添加底物酪醇，利用重组 或制备橄榄油过程中产生的残渣和废水提取和分离羟 菌转化生产羟基酪醇，最终获得一条制备羟基酪醇的 ［３４］ 基酪醇，但该技术制备成本高，难以大规模使用 。 生物转化技术途径。 化学合成法是以３，４二羟基苯乙酸和酪醇为原料化学 合成羟基酪醇，但是生产过程中催化剂价格昂贵且污 １　材料与方法 ［５６］ 染严重，因此也不是最佳制备手段 。生物转化是指