荧光定量PCR技术用于食品肉类种源掺假鉴定.docVIP

荧光定量PCR技术用于食品肉类种源掺假鉴定 　　在国内及国际贸易中，我国肉制品掺杂、以次充好的欺骗行为屡见不鲜，严重损害了消费者的利益，并且对我国出口肉制品在国际市场上的声誉造成损害。要杜绝这些掺杂使假的现象，关键手段是要建立一种能快速准确鉴别动物种源成分的检测方法，为上述产品的质量做本质上的把关，提高执法的科学性和高效性，进一步提高检验检疫通关速度。因此，建立一种快速、灵敏、特异的检测肉类种源的检测方法一直是有待解决的难题 目前，动物源性成分鉴别的主要方法有物理、化学、免疫学和分子生物学方法 物理学鉴别方法常用镜检法，通过观察来区分禽类、哺乳动物和鱼类，但该方法本身却并不能区分动物的种类。在检测的过程中，需要有经验的检验员进行操作，可以定量检测0.1%以下的骨片段 化学方法进行动物源性分析主要有色谱法和光谱法两种，但是化学方法的样品制备比较复杂，检测仪器相对较贵，无法分析高度处理过的样品 免疫学方法以检测蛋白质为基础，主要有同工酶检测、酶联免疫吸附分析（ELISA）以及电泳方法等，但其由于缺乏较高重现性和灵敏度以及受样品性质影响而受到限制。免疫学鉴别方法主要用于鉴别粗加工肉类的动物种类，只有少数的方法可以用于检测蒸煮肉类的蛋白质，因此很多的免疫学鉴别方法都不能用于热处理肉品 分子生物学方法主要有常规PCR、多重PCR、实时荧光PCR等，同时DNA杂交技术、PCR-电泳、PCR-限制性片段长度多态分析技术、随机引物的扩增法、环介导等温扩增技术、DNA基因检测手段式PCR技术等也是目前发展较为领先的几种分子生物学方法 荧光定量PCR通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。本方法检测原理主要利用一对动物线粒体基因保守区域特异性引物，配以FQ-Buffer、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过聚合酶链反应（PCR）-荧光法进行体外扩增，从而达到快速检测的目的 基于荧光定量分析技术，根据常见动物如猪、驴、牛、羊的DNA序列，设计并最后确定了特异引物，建立了荧光定量PCR检测方法，可以用于猪、驴、牛、羊肉及肉制品的种源成分快速鉴定检测分析，具有高效、快速、准确的特点，可进行批量样本快速检测。方法主要用于检测动物组织、血液以及食品、肉类制品、饲料中有动物种源性特定成份鉴定，是适用于政府检测机构、食品加工企业、进出口贸易企业的优秀的检测分析方法。并且检测结果能够达到与国家要求的行业检测标准相一致，与欧盟、美国FDA检测标准相符合 荧光定量PCR技术用于食品肉类种源检测方法建立 1 检测原理 本检测方法用一对线粒体基因保守区域特异性引物，配以FQ-Buffer、耐热DNA聚合酶（Taq 酶）、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过聚合酶链反应（PCR）-荧光法进行体外扩增，从而达到快速检测的目的，实现对动物组织、血液以及食品、肉类制品、饲料中动物源性成分的定性、定量分析 2 荧光定量PCR检测方法建立 对猪、驴、牛、羊等动物源样品进行预处理，进而对引物和探针设计、合成及使用，经过对动物源样品进行DNA提取与测定，构建荧光定量PCR反应体系，并在荧光定量PCR仪中进行反应，通过对反应体系、检测手段的不断优化，最终形成完善的荧光定量PCR检测方法 3 荧光定量PCR检测方法验证 以驴源检测方法为例，进行荧光定量PCR检测方法验证。将动物组织经过匀浆、离心等预处理，进行DNA提取。应用荧光定量PCR快速检测方法对动物组织中驴源成分进行检测。取出驴-qPCR MIX、Taq酶系，配制测试反应体系。向每管中加入处理后样品或驴-阳性质控品和阴性质控品，并将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置阴性控品，阳性质控品以及未知标本，并设置样品名称和循环条件，进行梯度循环反应，并对方法的特异性、灵敏性进行验证。反应结束后，判断反应结果 检测结果表明，本研究建立的荧光定量PCR方法具有良好的特异性，与国标方法的检测结果符合率为100%，未出现假阳性或假阴性结果 用试剂盒分别检测不同浓度驴肉组织的样品，分别为：约1/2检测限浓度（0.05%）样品10个、检测限浓度（0.1%）样品10个和2倍高于?z测限浓度（0.2%）样品10个测定（见表1） 检测结果：1/2检测限浓度（0.05%）样品的阳性率为40%（4/10）；检测限浓度（0.1%）样品的阳性率为100%（10/10）；2倍检测限浓度（0.2%）样品的阳性率为100%（10/10）。结果表明，该试剂盒对驴源性成分的检测限能达到的0.1% 利用本方法检测阴性样品20份，包括猪肉、羊