靶向于HER2的siRNA表达载体在人乳腺癌细胞SKBr3中的表达论文.docVIP

　　靶向于HER2的siRNA表达载体在人乳腺癌细胞SKBr3中的表达论文 鲍炜 张立红 付海京 贾林涛 张勇 刘家云 任新玲 温伟红 孟艳玲 王成济 杨安钢 【摘要】 目的：探讨针对HER2分子的RNA干涉对乳腺癌细胞生长的影响. 方法：人工合成DNA，经退火磷酸化后克隆入pSUPER载体. 基因转染后通过观察细胞形态和细胞计数等方法验证发夹状小干涉RNA(siRNA)对细胞生长状态的影响，以激光共聚焦检测基因表达情况. 结果：siRNA表达载体转染后可以引起SKBr3细胞大量死亡，间接免疫荧光检测出HER2蛋白表达降低. 结论：针对HER2进行RNA干涉可在体外抑制SKBr3细胞生长. 【关键词】 HER2；RNA干涉；基因治疗 【Abstract】 AIM: To investigate the effect of HER2targeted RNA interference (RNAi) on the groan breast carcinoma SKBr3 cells. METHODS: HER2targeted hairpin small interfering RNA (siRNA) genes entary single strand DNAs. pSUPER vector harboring each of the above genes ined by RTPCR and indirect immunofluorescence assay, and the effect of the HER2targeted siRNA on cell groorphological observation. RESULTS: Both RTPCR and indirect immunofluorescence assay revealed a remarkable decrease of HER2 expression in pSUPERsihe1 and pSUPERsihe2transfected cells, but not in pSUPER vector transfected cells. Cell proliferation atically inhibited after the expression of the HER2targeted siRNAs as shoicroscopic observation and cell counting. CONCLUSION: HER2targeted RNAi in SKBr3 cells can effectively inhibit the expression of HER2 gene and the proliferation of the cells in vitro. 【Keyab问世.freelpus公司）；Alpha ImagerTM 1220凝胶成像系统（Alpha Innotech公司）；SUNRISE酶标仪（澳大利亚TECAN公司）；PE2400 PCR仪（美国Perkin Elmer公司）；5417R台式低温冷冻离心机、5415D Centrifuge台式高速离心机（德国Eppendorf公司）. 1.2方法 1.2.1以HER2为靶分子的siRNA的设计及真核表达载体的构建根据人HER2基因设计4条寡聚脱氧核苷酸链（oligo）,序列为: oligo1: 5′gatcccctgatagacaccaaccgctcttcaagag agagcggttggtgtctatcatttttggaaa3′；oligo2: 5′agcttttccaaaaatgatagacaccaaccgct ctctcttgaagagcggttggtgtctatcaggg3′；oligo3: 5′gatcccctgaaacctgacctctcctatt caagagataggagaggtcaggtttcatttttggaaa3′；oligo4: 5′ agcttttccaaaaatgaaacctgacc tctcctatctcttgaataggagaggtcaggtttcaggg3′. 由赛百盛公司合成. 取两条DNA在退火缓冲液中退火，95℃ 4 min，70℃ 10 min，缓慢降温到4℃. 退火缓冲液组分为：100 mmol/L醋酸钾，30 mmol/L HEPESKOH, 2 mmol/L醋酸镁. 取退火后的产物磷酸化，产物与经Hind III和Bgl II双酶切的pSUPER载体进行连接，连接产物命名为pSUPERsihe1, pSUPERsihe2,转化E.coli DH5α菌