专题四-核酸鉴定技术.ppt

32p 1 5 10 * 1 4 8 10 * 加入蛋白质X 加入DNaseI凝胶电泳放射自显影 1 5 10 A B 足迹 (a) (c) (b) DNaseI 足迹实验 如果使用较大的DNA片段，通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。如同凝胶阻滞实验一样，我们也可以加入非标记的竞争DNA序列，来消除特定的“足迹”，并据此测定其核苷酸序列的特异性。 硫酸二甲酯（DMS）足迹实验： DMS能使裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶会对甲基化的G残基作特异的化学切割。 而与蛋白结合的DNA片段上的G残基，不会被DMS甲基化，从而避开了六氢吡啶的切割作用。于是在DNA片段的序列中，不存在这些G残基末端的DNA片段，出现了空白区。 甲基化干扰实验（methyltion interference assay） 根据DMS（硫酸二甲酯）能够使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理，设计出了另一种研究DNA与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰实验。这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。 DMS化学干扰的主要局限性是，它只能使G残基甲基化。尽管如此，它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。 具体操作如下页图所示。 G G G G G G m Ⅰ G G G Ⅲ m G G G m Ⅱ G G G m Ⅱ G G G m Ⅰ G G G Ⅲ m DNA 局部甲基化 与蛋白质提取物混合 与蛋白质结合 不与蛋白质结合 与蛋白质结合 凝胶电泳 与蛋白质结合的DNA带含有Ⅰ和Ⅲ两种类型DNA片段 不能与蛋白质结合的DNA带含有全部三种类型DNA片段 切下所有结合与不结合蛋白质的DNA带，并用六氢吡啶切割甲基化的G残基 结合带 非结合带 缺失的DNA带表明相应G残基的重要意义，它得到结合蛋白质的保护 甲基化干扰实验 体内足迹实验 G G × G G × me G G G G Me Me 完整的细胞 裸露的DNA DMS 硫酸二甲酯 分离DNA并用六氢吡啶切割 凝胶分析 PCR扩增 受保护的G残基 应用甲基化保护作用进行的体内足迹实验 DNA核苷酸序列分析（DNA测序） 传统的DNA序列分析法： Sanger双脱氧链终止法和 Maxam-Gilbert化学分析法 新发展的DNA杂交测序法 Sanger双脱氧链终止法原理： 双脱氧链终止法要求使用一种单链的DNA模板和一种适当的DNA合成引物。 利用DNA聚合酶的两种酶催化反应的特性：第一，DNA聚合酶能够利用单链的DNA为模板，合成出准确的互补DNA链；第二，DNA聚合酶能够利用2’，3’-双脱氧核苷三磷酸作底物，使之掺入到寡核苷酸链的3’-末端，从而终止DNA链的延长。 Maxam-Gilbert化学分析法 1977年由A.M.Maxam和W.Gilbert发明。 原理： 用化学试剂处理末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割。由此产生的一组具有不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳按大小分离和放射自显影之后，便可根据x光底片上所显示的相应谱带，直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。 下一次课内容 DNA的高通量测序 OVER! 重组克隆的鉴定：酶切和PCR 聚丙烯酰胺凝胶电泳 缓冲液：TBE 凝胶聚丙烯酰胺：丙稀酰胺/ 亚甲双丙稀酰胺（29：1）；TEMED和过硫酸铵（ 10％ ）。 可视化：EB、硝酸银 分离范围：1-1000bp PolyAcrylamide Gels 40kb? =40kb 40kb? 脉冲电场凝胶电泳（PFGE） 1984年，D.R.Cantor发明的。分离超大分子量的DNA分子。 在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 ℃角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 ℃角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向移动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。 核酸分子杂交鉴定技术 核酸分子杂交技术