康为世纪技术讲座-上医wbif-2.ppt

生物学反应系统检测原理 反应系统：蛋白与蛋白、核酸与核酸 指示系统： 酶、荧光素、同位素 抗原的种类 一 颗粒性抗原 细胞，细菌 二 可溶性抗原 表达蛋白 合成多肽 细菌或病毒的某种蛋白 抗原的要求 1 抗原量的要求，蛋白2mg,多肽 5~6mg 2 纯度要求，蛋白纯度要90%以上，SDS要一条带，多肽纯度要85%以上。 3 蛋白背景，是否带有标签蛋白？与其他蛋白的同源性 康为提供的服务 1 蛋白表达，制备抗体 2 客户提供蛋白序列，我们提供蛋白表位预测、多肽合成，多肽与载体交联，制备抗体 3 抗体制备后的后续服务， 抗体的纯化，蛋白A/G，抗原或多肽的特异性亲和纯化 抗体的标记，HRP，FITC 抗体识别不同表位的测定 ELISA 配对抗体的筛选 IHC、WB 的应用 间接Western Blotting操作流程 康为世纪化学发光底物特点 高灵敏度：比显色法高103-106倍 灵敏度选择（普通型10-11g,增强型pg级别） 节约抗体:其它底物用量1/10－1/1000 强信号，长发光，8－24小时 底物稳定，常温保存 检测快速：1-5分钟 高特异性，高信/噪比 检测方便： X光片或CCD检测 多次曝光：选择满意的信号强度 * 化学发光底物选择原则 样品丰度 检测灵敏度 * 内容 背景知识 1 WB操作流程 2 WB常见问题分析 3 IHC操作流程 4 IHC常见问题分析 5 常见问题分析 比较均一的高背景 信号弱或者无信号 非特异性条带 信号下降太快 比较均一的高背景 原因： 解决办法 抗体浓度太高 优化/降低一抗和二抗浓度 漂洗不完全 增加漂洗时间和缓冲液体积 漂洗液中加入Tween-20；浓度0.05％ 封闭液不适合 比较尝试不同的封闭液 封闭不完全 封闭液的选择与优化 增加封闭液中蛋白质浓度 优化封闭时间和温度（RT至少1小时；4℃过夜） 抗体与其它蛋白质交叉反应 更换不同的封闭液；勿在Biotin/avidin体系中使用脱脂奶粉封闭 降低二抗浓度 检测二抗与膜的交叉反应性 原因： 解决办法 曝光时间太长 缩短曝光时间 膜的问题 使用干净镊子；戴手套操作 换一张新膜 用足够的液体，膜始终保持湿润 孵育时使用脱色摇床 避免膜重叠，互相覆盖 小心操作，勿毁损膜 缓冲液污染 使用新缓冲液 过滤缓冲液 比较均一的高背景－续表 信号弱或者无信号 原因： 解决办法 转膜不完全 1.转膜后，确定转膜效率 2.保证转膜时胶与膜充分结合 3.滤纸－膜－胶，电极方向正确装配 4.根据说明书，对膜进行处理如湿润 5.电转时防止过热 6.使用阳性对照或预染Marker 7.优化转移时间和电流 8.保证样品处理时，样品不被破坏（抗原决定簇） 蛋白质与膜结合不充分 加20％甲醇于转膜缓冲液； 低分子蛋白质透过膜；使用小孔径膜 抗体 增加抗体浓度；抗体与抗原结合差；抗体丧失活性 抗原不足 增加上样量 抗原被封闭液遮蔽 试用不同的封闭液 优化封闭液中蛋白质浓度 缩短封闭时间 缓冲液里有叠氮钠 去掉叠氮钠 曝光时间太短 延长曝光时间 底物孵育时间太短 5分钟 膜的选择错误 注意膜的质量 底物丧失活性 避免使用超过有效期的底物试剂 膜上蛋白质被消化（gelatin) 封闭物质可能有蛋白质降解活性 蛋白质在储存过程中降解 重新制备样品 信号弱或者无信号－续表 非特异性条带 原因： 解决办法： 底物太灵敏 选择合适的底物 交叉反应 选择单克隆抗体 抗原浓度太高 降低抗原浓度 抗体浓度太高 降低抗体浓度 曝光时间太长 减少曝光时间 A 1：5000 B 1：10000 C 1:5000 D 1:10000 抗血清检测结果 信号下降太快 原因： 解决办法： 抗体浓度太高 1.降低抗体浓度，特别是二抗浓度 推荐 对照设置 内参照 beta-actin /beta-tubulin/GAPDH 阳性对照 检测一抗是否正常 阴性对照 检测一抗特异性 空白对照 不加一抗，光加二抗，检测二抗是否发生交叉反应 * 优化条件 电泳分离蛋白质：蛋白抽提，样品制备，电泳 转膜：膜的选择，转膜确认 封闭：封闭液选择，