银杏AFLP 反应体系建立及优化.docVIP

银杏AFLP反应体系的建立及优化 郭彦彦1，唐文煜2，邢世岩1*，谭洪才3，王利1 （1.山东农业大学林学院，泰安 271018； 2.济南市林果技术推广站，济南 250000； 3.济南市林业局，济南250000） 摘要：以6个银杏种质为试材，通过对影响AFLP技术的多种因素进行研究，建立了一套适合银杏的AFLP技术优化体系。优化的关键因素为：①模板DNA的质量：经多次抽提纯化，将DNA沉淀挑出，而不采用离心方法，获得高纯度的DNA；②酶切时DNA模板为300ng，反应时间为6h；③连接最适反应时间为10h；④预扩模板即连接产物最佳用量为1μl；⑤预扩增产物最适稀释倍数为70倍。 关键词：银杏，AFLP，体系优化 The establishment and optimization of AFLP technical system in Ginkgo bilola Guo yan-yan1，Xing shi-yan1，Tan hong-cai2，Wang li1 (1. College of forestry Shandong Agricultural University, Taian, 271018; 2.) Abstract: Some factors affecting the AFLP analysis system of six Ginkgo bilola germplasms were studied, and an optimized system was established.The important factors in the system are: ①quality of template DNA.②300ng template DNA should be used in the digest system with the reaction time is 6 hours.③the time of ligation should be 10 hours at least.④one microlitre ligation products is used as the template of preamplification.⑤the products of preamplification are diluted to 70 times with 1 XTE for selective amplification. Key words: Ginkgo bilola, AFLP, optimization of the system AFLP(Amplified fragment length polymorphism)技术是1993年由荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的新方法[1]，较其它DNA分子技术有DNA用量少、重复性好、多态性丰富、不需知道基因组序列信息、高效可靠等优点[2,3]。其基本原理是对基因组酶切片段的选择性扩增，不同基因型DNA的酶切位点不同，从而产生了扩增片段的长度多态性。AFLP技术自1995年以论文形式正式发表以来已被广泛用于生物多样性[4,5]、系统发育[6,7]、图谱构建[8]、基因定位[9]、品种鉴定及分子育种[10]等研究中，它尤其适用于一些多态性低或特定品种的遗传研究和连锁图谱的构建。2003年，雷永等建立并优化了花生的AFLP体系[11]；2003年，明军，张启翔等进行了梅花AFLP反应体系的建立与优化研究[12]；2004年，闫龙等优化了木豆种质资源遗传多样性研究中的AFLP技术[13]。 银杏（Ginkgo bilola L.）是经第四纪冰川后唯一在中国保存下来的孑遗植物，具有高度的生态保守性（ecological conservation） [14]。银杏分子生物学方面近些年来也有研究，谭晓风等（1998）利用RAPD标记技术首次构建了银杏分子遗传图谱[15]；陈月琴等（1999）研究了银杏雌株的ITS序列，表明了该类植物形态上的变化与分子进化的不一致[16]；王晓梅，陈瑞阳等（2001）使用试剂盒利用AFLP技术检测雌雄银杏基因组DNA的多态性，筛选了与银杏性别相关的分子标记[17]。葛永奇等（2003）利用ISSR技术研究了江苏泰兴、美国、浙江西天目山、湖北大别山、贵州务川五个银杏群体的遗传多样性和遗传结构，构建了群体间、个体间的亲缘关系图 [18]。沈永宝等（2005）不同的模板浓度及酶切时间的酶切效果不同，本研究利用不同的模板浓度进行不同时间的酶切反应发现，在300～700ng范围内AFLP对于模板DNA的浓度并不敏感，但是过低，产生的限制性酶切片段量少，会影响以后各程序的进行；在6h～10h范围内，酶切时间对AFLP