三、新一代DNA测序技术.PDF

生生命命奥奥秘秘wwwwww..lliiffeeoommiiccss..ccoomm 三、新一代DNA测序技术 DNA测序技术已广泛应用于生物学研究的各个领域，很多生物学问题都可以借助高通量DNA测序技术 予以解决。过去三年，大规模平行测序平台 （massively parallel DNA sequencing platform ）已经发展为主 流的测序技术，这项测序技术的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前 专属于大型测序中心的 “特权”能够被众多研究人员分享。目前，新的测序技术及手段还在不断涌现，比如 最新的进展就包括建立序列数据库、建立序列数据分析新方法以及设计测序试验等等。新一代DNA测序技术 有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。 今后，各种测序将成为一项广泛使用的常规实验手段，这有望给生物学和生物医学研究领域带来革命性的变 革。 DNA 测序技术经历了漫长而曲折的发展历程。迄今为止，我们获得的绝大部分DNA 序列都是基于 Sanger测序法获得的。在过去5年间，人们至少从以下四个方面刺激了DNA测序技术的发展 （表2 ）。 表2 刺激DNA测序技术发展的四个方面 人类基因组计划的出现，使人们面临了巨大的经费问题，因为传统的Sanger测序法无论如何优化，也无 法大幅度降低测序费用； 人类以及其它主要模式生物参考序列数据库的建立使得短片段作图成为可能，这极大地促进了短片段测 序技术的发展； 不断涌现的新型分子生物学技术极大地促进了分子生物学的发展，随之而来的越来越多的比如基因变 异、RNA表达、蛋白与DNA相互作用以及染色体构象等等生物学现象需要人们用高通量DNA测序手段去 解释，这也极大地促进了新型测序技术的发展； 其它学科、各项相关技术的发展，例如显微镜技术、表面化学技术、核苷生化技术、聚合酶工程技术、 计算机技术、数据储存及分析技术等，为DNA测序技术提供了极大的支持。 1. 具有代表性的新一代DNA测序仪 最近市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、 美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的 SOLiD测序仪、Dover/ Harvard公司的Polonator测序仪以及美国Helicos公司的HeliScope单分子测序仪。所 有这些新型测序仪都使用了一种新的测序策略——循环芯片测序法 （cyclic-array sequencing ），也可将其 称为 “新一代测序技术或者第二代测序技术”。 所谓循环芯片测序法，简言之就是对布满DNA样品的芯片重复进行基于DNA 的聚合酶反应 （模板变性、 引物退火杂交及延伸）以及荧光序列读取反应。2005年，有两篇论文曾对这种方法做出过详细介绍。与传统 测序法相比，循环芯片测序法具有操作更简易、费用更低廉的优势，于是很快就获得了广泛的应用。 44 a DNA分子被随机切割成小片段 b DNA分子被随机切割成小片段 体内克隆扩增 体外接头连接 循环测序 制成polony芯片 模板 引物 聚合酶 dNTPs 荧光标记的ddNTP 芯片循环测序 电泳 (每个芯片可以获得长度超过106 bp的序列)