无标记转Fat-1基因真核表达载体的构建及转基因绵羊细胞系.PDF

212 生 物 工 程 学 报 阿力玛 等/无标记转Fat-1 基因真核表达载体的构建及转基因绵羊细胞系的建立 Chinese Journal of Biotechnology /cjbcn February 25, 2016, 32(2): 212−221 DOI: 10.13345/j.cjb.150149 ©2016 Chin J Biotech, All rights reserved 组织工程与细胞培养 Fat-1 * * 阿力玛 ，朱和平，王瑞瑶，闫涛，苏小虎，李璐，王丙萍，那顺温都乐，齐贵春，周欢敏 010018 , , , . Fat-1 . , 2016, 32(2): 212–221. A LM, Zhu HP, Wang RY, et al. Construction of Fat-1 eukaryotic expression vector of excision markers and the establishment of transgenic sheep cell lines. Chin J Biotech, 2016, 32(2): 212–221. 摘 要: 为了建立无筛选标记基因的转Fat-1 基因绵羊细胞系，本研究将PCR 克隆得到的Fat-1 基因，合成的 attB 、Loxp 序列并克隆入pN1-EGFP 框架载体，得到可删除筛选标记基因的pEGFP-N1-Fat-1 真核表达载体。 体外转录合成phiC31 整合酶mRNA 并与线性化的pEGFP-N1-Fat-1 载体共转染绵羊胎儿皮肤成纤维细胞，G418 筛选得到表达绿色荧光的单克隆，再利用pET-28a-His-NLS-TAT-Cre 质粒诱导 Cre 重组蛋白表达，将纯化后的 Cre 穿膜肽转导表达绿色荧光的单克隆细胞，将荧光淬灭的细胞系扩繁，提取基因组DNA ，进行PCR 及测序 鉴定，得到无标记转Fat-1 基因绵羊胎儿皮肤成纤维细胞系，为生产无筛选标记基因的转基因绵羊奠定基础。 : Fat-1 基因，真核表达载体，筛选标记，phiC31 整合酶 Construction of Fat-1 eukaryotic expression vector of excision markers and the establishment of transgenic sheep cell lines * * Lima A , Heping Zhu , Ruiyao Wang, Tao Yan, Xiaohu Su, Lu Li, Bingping Wang, Shunwendoule Na, Guichun Qi, and Huanmin Zhou Key Laboratory of Biological Manufacturing of Inner Mongolia Autonomous Region College of Life Science, Inner Mongolia Agricultural University , Hohhot 010018, Inner Mongolia, China Abstract: In order to establish marker-free transgenic cell lines, we cloned Fat-1 gene, attB and Loxp sequences by PCR. Received: March 27, 2015; Accepted: November