用质粒作底物测定核糖体失活蛋白酶活性的新方法.pdfVIP

·992· 生物化学与生物物理进展P阳g．Bioch蜘k 酶活性的新方法．该方法既避免了提取制各核糖体、 一20℃冰箱中保存待分析，待取样过程全部结束后， 检测RNA所需设备和技术的限制，又可以大大缩 用O．8％琼脂糖凝胶电泳分析． DNA 短测定的时间，也避免了使用放射性同位素的污 1．2．4检测RIP的灵敏度．取质粒PUcl8 染．所用的质粒DNA和其他化学药品和仪器都容 (o．5 u曲与不同量的天花粉蛋白(2，O、1．O、0．5、0．1 易得到，使测定酶活性的方法简单化，有利于广泛 和深入地开展对RP的研究． 后，加入1LLl的1．0％SDS终止反应，用O．8％琼 脂糖凝胶电泳分析． 1材料和方法 1．2．5不同的质粒PuCl9DNA或PBR322DNA为 1．1材料 底物测RIP的酶活性．分别取2种质粒Pucl9或 PBR322 1．1．1质粒DNA和RIP．质粒兀圮18、PuCl9和 DNA(皆为O．5¨曲与不同量的辛纳毒蛋白 PBR322 DNA为Fe加entas公司产品；使用的RJP 一起保温，重复上面的实验操作，目的是重复和进 有2种：天花粉蛋白由上海生物化学与细胞生物学 一步验证RⅢ对不同质粒DNA作用的差异． 研究所聂惠玲研究员惠赠；辛纳毒蛋白是从香樟树 2结 果 (ann—ommc口坤b曲种子的提取液中，采用 Sephamse4B柱亲和层析，乳糖洗脱，得到的冻干2．1用质粒PuCl8DNA为底物测定天花粉蛋白 粉吧 的酶活性 1．1．2主要试剂．琼脂糖为Serva进口分装，其余药天花粉蛋白能脱去超螺旋DNA分子中A“含 品均为国产分析纯． 量丰富区域的、局部单链结构位置上的腺嘌呤碱 1．2方法 基，脱去腺嘌呤后DNA的磷酸二酯键十分脆弱， 1．2．1辛纳毒蛋白的还原，辛纳毒蛋白是Ⅱ型R巾， 超螺旋结构所产生的张力就容易使DNA链断 其A．和B一链间由一对二硫键连接，测定酶活性 裂刚，“．天花粉蛋白对质粒PuCl8D1qA降解的结 前，必须用DTT打开二硫键取辛纳毒蛋白冻干粉 果见图1．实验结果显示：超螺旋DNA在天花粉蛋 mmo儿 白的作用下，脱去一些嘌呤碱基后转变为缺刻和线 (1．Om曲溶解于适量的缓冲液A(50 Tris-HCl，DH7．5， 1 mmol几【)1T，50姗ol几状的DNA(图1．2)，经酸性苯胺处理，脱腺嘌呤的 Kcl，lO mmol几D1qA在脱腺嘌呤处断裂，被完全降解成小片段而 mnlol几MgcU中，再加入5 DTT，于37℃保温30min，以打开辛纳毒蛋白分 逸出凝胶(图1寸)．纯的R口与质粒DNA保温，电 子内的二硫键，A．链和B一链未经分离，于一20℃泳分析中，出现缺刻和线状DNA就可以测定R口 的冰箱中保存备用． 的酶活性．如果测定粗提取液中RIP的酶活性，必 1．2．2用质粒Pucl8DNA为底物测定RIP的酶活 需经过酸性苯胺处理，再经凝胶电泳确认质粒 性．取质粒Pucl8 DNA(0．5“g)分别与不同浓度的DNA转变为小的DNA片段(一般皆逸出凝胶)，才 天花粉蛋白或辛