引物设计原则及PP5.0设计软件.pptVIP

引物设计原则及设计软件 引物（primers) 引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。 → ← 3’ 3’ 5’ 5’ Sense primer Antisense primer PCR引物设计及相关软件使用 → ← Sense primer Antisense primer 选择模板序列保守区域 1、引物设计原则 引物长度 碱基分布的均衡性 Tm值 引物二级结构 引物3’端 引物5’端 引物的内部稳定性 自由能分布 引物长度 一般引物的长度为15-30 bp，常用的长度为18-21bp。过长或过短都不合适，为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应，长度大于24 核苷的引物并不意味着更高的特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。引物过短会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（18bp的序列在人类基因组中只会出现一次）。 决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度 Tm =（g + C）* 4 +（a + T）* 2 同一碱基连续出现不应超过5个 GC含量一般40-60%，以45-55％为宜 GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性 GC含量太高也易于引发非特异扩增。 碱基分布的均衡性 有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。 引物Tm值 一般要求：55℃-65℃。 应尽可能保证上下游引物Tm值一致，一般差异控制在2 ℃以内。 （引物的退火温度相差小于5℃一般不会影响PCR的产率，理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55℃～80℃间变化，有说接近72℃为最佳） 上下游引物Tm值与产物Tm值一般应控制在20 ℃以内。 一般采用较低引物Tm值-5℃作为PCR退火温度。 一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。若G+C含量太低，可在5端加上一些G或C，若G＋C含量太高，可在5端加上一些A或T。 引物二级结构 引物二聚体（引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性 ） 尽可能避免两个引物分子之间3’端有较多碱基互补 发夹结构（引物自身连续互补碱基不能大于3bp ） 尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。 （两项结构的能值以不超过4.5为好，引物中间或5’端可适当放宽） 两引物之间不应该存在互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。 引物3’端 引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。 引物3’端的碱基一般不用A（3’端碱基序列最好是G、C、CG、GC）。另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。 3’端的连续3个G 或C ，如GGG或CCC，会导致引物在G+C富集序列区错误引发 引物5’端 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基（对PCR 影响不大），常在5’端引入修饰位点或标记物。 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）。 5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。 双酶切位点，有利于定向克隆，2-3个保护碱基，一般加CG。计算引物Tm 值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。 引物的内部稳定性 过去认为，引物3’端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，故3’端最好为G或C。 现在的观点认为，引物的5’端应是相对稳定结构，而3’端在碱基配对的情况下最好为低稳定性结构，即3’端尽可能选用A或T（有说不适宜用A），少用G或C。 若模板不很清楚，引物3’端最后一个碱基最好为T，其次是G或C，而不选A，国外资料表明，当末位为T时，即使在错配的情况下也能引发链的合成，而末位为A时，错配时引发大大降低，G或C居中，可见，模板很清楚时选A可以提高特异性。 自由能分布 ?G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性（结合的强弱程度）。 一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9 （绝对值，一般考虑末端5个碱基的ΔG。此值的大小对扩增有较