选1-5-3血红蛋白的提取与分离.pptVIP

课题3 血红蛋白的提取和分离;知识回顾--------有关蛋白质的几个问题：;知识回顾--------有关蛋白质的几个问题：;基础知识;阅读并回答　　　　　　　　（P64） 1、凝胶色谱法另一个名称； 2、凝胶色谱法分离蛋白质的依据； 3、凝胶的实质； 4、凝胶色谱法 5、凝胶色谱法的原理。;1、凝胶色谱法的别名：分配色谱法 是根据相对分予质量的大小分离蛋白质的有效方法。 ;基础知识　　　　（一） 凝胶色谱法; 原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（ ）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（ ），移动速度（ ），而（ ）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（ ），移动速度（ ），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。; 1、缓冲物质有哪些？ 2、缓冲溶液的作用是什么？ 3、怎样配制缓冲溶液？;1、缓冲溶液概念;思考： 你认为在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？ 它的目的是什么？;阅读第65页的相关内容，回答以下问题： 1、电泳的概念； 2、电泳的原理； 3、电泳的种类； 4、SDS的作用。;1、概念;基础知识　　　　　　（三）电泳;⑶.常见电泳类型：;为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入( )。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是( )。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于( )。;实验操作;实验操作;血液; 血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。在红细胞的组成中，约90％是血红蛋白。血红蛋白由四个肽链组成(如图)，包括两个α-肽链和两个β-肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分了二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而呈现红色。; 每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色;1、红细胞的洗涤; 速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果。;2.血红蛋白的释放;3.分离血红蛋白溶液; 取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12h。;4.透析; 阅读课本相关内容，了解凝胶色谱的操作过程。;实验操作 （二）凝胶色谱操作;2.凝胶色谱柱的装填;2.凝胶色谱柱的装填;3.凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙； 装填凝胶柱时不得气泡存在。（因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。）; 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300mL的20mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12h。;3.样品的加入和洗脱 ;3.样品加入与洗脱;⑤收集：;答：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。; 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括： 样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理； 再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离； 然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的纯化； 最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。;课题3 血红蛋白的提取与分离