柱层析 第七组.ppt

陈雪燕 陈湘 罗芳芳 张洁娣 曹静怡 郑立君 ;层析的原理;流动相 在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。 柱层析中一般称为洗脱剂 薄层层析时称为展层剂。 ;按操作形式不同分类;柱层析的基本操作;⑴ 装柱;关闭层析柱出水口，并装入1/3柱高的缓冲液，并将处理好的吸附剂等缓慢地倒入柱中，使其沉降约3cm高。 打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液。（吸附剂的多少根据分离样品的多少而定。）注意不能干柱、分层，否则必须重新装柱。 最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有2~3cm高的缓冲液，同时关闭出水口。（采用机械化装柱法在此省略。）;装柱示意图;⑵ 平衡;⑶ 加样;(4) 洗脱;⑸收集、鉴定及保存;⑹ 基质的再生;层析柱的分类; ２.硅胶层析 结构通式为：SiO2·x H2O，具硅氧烷（-Si-O-Si）高链结构，表面有很多硅醇基（SiOH），基本骨架如下： 特性： 属亲水性吸附剂，吸附力较Al2O3弱（应用范围也比它广），显微酸性。 应用（比氧化铝广）：　 亲脂性成分、或极性成分、某些能与氧化铝起反应或结合的成分（如，黄酮类，可形成Al盐螯合物） 尤适合于酸性成分 碱性成分，首选氧化铝 酸性成分，首选硅胶 样品上柱量： 较Al2O3低（因其吸附力弱） ; ３.活性炭层析 特性： ①属亲脂性（非极性）吸附剂 对亲脂性物质，吸附力强，在水中吸附力强 对亲水性物质，吸附力弱，在亲脂溶剂中，吸附力弱（竞争吸附），洗脱剂极性越低，其吸附剂越强，溶剂洗脱力越　　。 ②有选择性吸附：对-COOH、-NH2、-OH等基团吸附力强，并与基团数量有关，上述极性基团多 基团少 另有下列吸附力差异： 对芳香族化合物 对脂肪族化合物（分离水溶性芳香族化合物与脂肪族化合物） 对大分子量化合物 对小分子量化合物（分离单糖／多糖、蛋白质／多肽） 分类（常用活性炭类型）： 粉末状：总表面积大，吸附力、吸附量大，颗粒细，流速慢（需加压或减压） 颗粒状：总表面积减小，吸附力、吸附量减小，颗粒粗，流速加快 锦纶－活性炭： 注：以锦纶为粘合剂，将粉末制成颗粒，总表面积介于上二者之间，吸附力弱于上二者。 应用： 常用于分离水溶性物质（如氨基酸、糖类及某些苷类） 洗脱剂：水最弱，亲脂性溶剂较强。常用醇－水系统，随乙醇浓度渐增，洗脱力增强。 ; ４.聚酰胺层析 组成：高分子聚合物 特性：属半化学吸附类型，其中的酰胺键可与酚-OH，-COOH，或醌式结构等形成氢键，其吸附性强弱与形成氢键的强弱及有关基团的数目有关。 应用： 分离能与其中的酰胺键形成氢键的化合物。如黄酮、蒽醌、有机酸、酚类等（弥补氧化铝的不足），极性、非极性物质均可使用。（详见各论）;菠菜中的叶绿素提取;在选择溶剂时主要依据下面几条原则：;主要仪器与试剂;实验装置;实验流程图;实验步骤; 2.装柱 在层析柱中，加3cm高的石油醚。另取少量脱脂棉，先在小烧杯用石油醚浸湿，挤压以驱除气泡，然后放在层析柱底部，轻轻压紧，塞住底部。将3g层析用的中性氧化铝（150~160目），从玻璃漏斗中缓缓加入，小心打开柱下活塞，保持石油醚高度不变，流下的氧化铝在柱子中堆积。必要时用橡皮锤轻轻在层析柱的周围敲击，使吸附剂装得均匀致密。柱中溶剂面由下端活塞控制，既不能满溢，更不能干涸。装完后，上面再加一片圆形滤纸，打开下端活塞，放出溶剂，直到氧化铝表面溶剂剩下 1~2mm高时关上活塞（注意！在任何情况下，氧化 铝表面不得露出液面）。 ; 3.分离、收集 将上述菠菜色素的浓缩液，用滴管小心地加到层析柱顶部，加完后，打开下端活塞，让液面下降到柱面以上1mm左右，关闭活塞，加数滴石油醚，打开活塞，使液面下降，经几次反复，使色素全部进入柱体。 待色素全部进入柱体后，在柱顶小心加洗脱剂—石油醚-丙酮溶液9:1（体积比）。打开活塞，让洗脱剂逐滴放出，层析即开始进行，用锥形瓶收集。当第一个有色成分即将滴出时，取另一锥形瓶收集，得橙黄色溶液，它就是胡萝卜素。 用石油醚-丙酮7:3（体积比）作洗脱剂，分出第二个黄色带，它是叶黄素（1）。再用丁醇-乙醇-水3:1:1（体积比）洗脱叶绿素a（蓝绿色）和叶绿素b（黄绿色）。 ;注意事项