李斯特菌的快速检测方法.ppt

李斯特菌的快速检测方法 专 业：食品科学 2 以分子生物学为基础的检测法 目 录 以免疫学为基础的检测法 展 望 快速检测方法 5 以免疫学为基础的检测法 免疫学 快速检测法 单克隆抗体酶联免疫法 酶联免疫荧光检测法 * 在1992年，Besson等人首次发现一株能稳定分泌抗单核细胞增生性李斯特菌的特异单克隆抗体的细胞株EM-TGI，以此特异性单克隆建立的夹心ELISA方法能20~24h内检出含8~10个/g的样品。这是病原性李斯特菌检测中重大突破，第一次利用酶联免疫方法把单核细胞增生性李斯特菌和非致病性李斯特菌分开。 单克隆抗体酶联免疫法 * 单克隆抗体酶联免疫法 以后陆续的有利用单克隆抗体ELISA检测的报道，有李斯特菌属特异表位单克隆抗体，它们所针对的是表位为菌体表面蛋白质分子量为3000~3800KD，用此表位单克隆抗体构成的夹心ELISA检测技术能在预增菌后24h报告结果，且最低检测浓度为5×105个/mL。 * 1985年，Mclaulin等人采用酶联荧光检测法，将异硫酸荧光素结合到李斯特菌的两株单克隆抗体上，对李斯特菌进行了直接的荧光检测，证实了香软干酪等动物性食品中李斯特菌的检测只需2h可完成。焦新安在1994年研制了3株具有特异表位的单克隆抗体C11、B18、B5，建立了快速检测李斯特菌的间接免疫荧光和ELISA，节省了检测的时间。 酶联免疫荧光检测法 * 酶联免疫荧光检测法 采用酶联荧光检测法制成的VIDAS检测伐，可实现全自动检测，自动培养、选择菌，并分析，全部结果都由机器自动输出，快速、简便、省时。翁文川等人在VIDAS自动检测仪器上API Listeria鉴定卡，不仅可以快速检测出李斯特菌而且还可以李斯特菌属。准确、快速、方便且具有广谱性。 5 以分子生物学为基础的检测法 分子生物学 快速检测法 寡聚核苷酸DNA探针杂交检测法 PCR技术检测法 寡聚核苷酸DNA探针杂交检测法 对于血清型的李斯特菌在已知某一序列的保守性，可设计出人工合成的短聚核苷酸。如Datta等人在1988年克隆出单核细胞增生性李斯特菌β溶血素基因，一个50bp大小的基因片段，把此片克隆进M13噬菌体载体并测定它的核苷酸序列，依其序列合成它们的4种寡聚核昔酸探针,以32P标记该探针,经斑点杂交实验证实该探针只与单核细胞增生性李斯特菌反应,而与其他种的李斯特菌反应呈阴性,表现出良好的特异性。 寡聚核苷酸DNA探针杂交检测法 在1990年时从单核细胞增生性李斯特菌ScoTTA的DNA文库中克隆出3.Ikb的编码单核细胞增生性李斯特菌溶血素O基因。用Hindn III对此基因进行酶切,克隆出位于溶血清650bP的片段,以溶血素。基因和它的650bP的Hnid III消化片段作探针,对单核细胞增生性李斯特菌进行检测,此基因对该菌表现出高度的特异性和敏感性。 PCR技术检测法 自1980年PCR技术发明以来,已得了广泛运用,其主要的原理是用一对寡聚DNA作为引物。其步骤使要扩增的DNA在较高的温度下变性解链,在较低温度下退火,然后升高温度复制延伸。如此重复20~30次,就可以扩增DNA,然后检测。 采用同步PCR技术对单核细胞增生性李斯特菌检测和分类也可解决代PCR受干扰的问题,同步PCR技术是在RAPD分析技术和COGEDET分析技术上发展而来的。它是采用任意带有特异基因引物位点RAPD,利用李斯特菌的4条已知引物HLYA、PRFA、ISP和FLIA气和6个RAPD引物组合来检测单核细胞增生性李斯特菌。此法可直接从受污染的食品、强化肉汤中检测李斯特菌,快速,灵敏 2.2 浸泡时间的选择 PCR技术检测法 Fluit等建立的一种新型系统磁免疫PCR(MI-PA)检测法,此法以单核细胞增生性李斯特菌和无害李斯特菌的单抗Mab55包埋磁珠,直接从样品中分离以上两种细菌,经裂解,李斯特菌释放DNA,以溶血素O基因和迟发变态反应DTH基因来设计引物,经30次循环,可得单核细胞增生李斯特菌的PCR产物,然后检测。此法十分敏感,缩短了时间。 展望 11 1 2 3 目前对李斯特菌的所有检测方法,花费的时间都较多,大都在20~48h. 因此,有必要改进或建立一些新的检测法,如建立在分子水平上的无须增菌而直接检测—流动细胞计的特异快速分析 如在免疫学上利用特异抗体敏化的免疫色谱,几滴样品加到卡片上,肉眼或普通放大镜就可看出反应特征,得出结果,且时间不超过10min