核酸提取原理及方法.ppt

质粒DNA提取常见问题分析 质粒断裂 II 液裂解时间过长？ 裂解时动作过于剧烈？ 质粒DNA提取常见问题分析 量少 凝胶是否有问题？ 菌体量少 菌体重悬不彻底 裂解不完全 菌株老化 严谨型质粒 质粒类型 严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下进行的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝； 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下进行的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。 核酸简介 基因组DNA提取 质粒DNA提取 真核细胞总RNA提取 琼脂糖凝胶电泳 总RNA提取——通用方法 异硫氰酸胍/苯酚法（TRIzol法） 原理： 核酸在中性条件下，因磷酸基解离而带负电荷，这一部分由于水化而溶于水。而在酸性条件下，磷酸基的负电荷消失，水溶性下降。因此，在酸性酚的处理下，DNA向疏水性的酚层移动，而RNA由于有-OH的存在有亲水性，因此向水层移动。 TRIzol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA便分离开。水相层主要为RNA，有机层主要为DNA和蛋白质。 总RNA提取及检测——实验准备 1.实验器材 台式高速冷冻离心机、移液器、定时器、 marker笔、酒精喷壶、 电子天平、电泳设备、凝胶成像系统（或紫外透射仪）、紫外分光光度计、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。 2.实验耗材 1.5 mL EP管（RNase free）、各规格Tip （RNase free） 、 一次性手套、一次性口罩等。 3.实验试剂 TRIzol 总RNA提取试剂（YRBIO) 、氯仿、异丙醇、75%乙醇 （RNase free）、DEPC H2O （RNase free） 等。 4.实验材料 新鲜293细胞 RNase是导致RNA降解的最主要物质！ RNase的来源 样品 试剂 多次使用的器具 裸露的手 说话产生的唾沫 空气 RNase非常稳定，它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。 总RNA提取——去除RNase污染 玻璃器皿处理： 量筒、试剂瓶等玻璃器皿须200℃烘烤2小时以上。 塑料器皿处理： 0.1%DEPC水溶液浸泡过夜，再高温高压灭菌。 试剂处理： 氯仿、异丙醇、无水乙醇新开后RNA专用。0.1%DEPC水配制75%的酒精。 专用的RNA操作室、专用器械。 操作时戴口罩、手套、帽子、穿实验服。 总RNA提取——样本准备 植物/动物组织样本： 新鲜取材或组织离体后液氮速冻，存于液氮或-80℃。 为避免反复冻融，需小份分装（50~100 mg/份）。 细胞样本： 新鲜收集待用或加入TRIzol后 -80℃冻存细胞沉淀。 血液样本： 新鲜血液分离出淋巴细胞，待用或加入TRIzol后 -80℃ 冻存细胞沉淀。 真核细胞总RNA提取——实验步骤 293细胞样品为例 收集细胞 上层溶液 离心洗涤 裂解变性 异丙醇沉淀 抽 提 RNA溶液 干燥溶解 详细实验步骤请参考说明书！ 总RNA提取——完整性检测 293细胞总RNA 28S 18S 5S 由于动物细胞中70-80% 的RNA为rRNA，后者又由28S（约4800 nt），18S（约1900 nt）和5.8S（约120 nt）三种组成，所以电泳后应该在UV下看见三条清晰的rRNA带。 由于核酸长度与结合EB的数量成正比，所以28S rRNA条带的荧光强度一般比18S rRNA条带的荧光强度强1.5-2.3倍。如果这两条rRNA带不清晰或比例小于此范围则表示RNA有降解（因为大的RNA被酶降解的可能更大）。 电泳检测 总RNA提取——产量产率与纯度检测 1.打开紫外分光光度计设定参数，具体操作参照仪器说明。 2.取少量待测RNA样品，用TE Buffer稀释50倍（或100倍）。 3.用TE Buffer做空白，在260 nm、280 nm、310 nm处调节紫外分光光度计的读数至零。 4.加入待测RNA样品在三个波长处读取OD值。 总RNA提取——产量产率与纯度检测 5.根据OD值计算RNA的浓度： [SSRNA] = 40×