植物体细胞.pptVIP

第九章第二节 植物体细胞杂交 （plant somatic hybridization） 主要内容 概述 细胞融合技术（重点） 融合细胞的筛选（难点） 再生植株的鉴定 体细胞杂交的应用 一、概述 1、概念： 植物体细胞杂交（plant somatic hybridization） ：又称原生质体融合（protoplast fusion）， 是将不同亲本植物的原生质体通过人工方法诱导融合，并进行离体培养再生杂交植株的技术。 例：番茄+马铃薯 一、概 述 2、研究进展：植物体细胞杂交技术起源于20世纪70年代，用于克服远源杂交不亲和的现象。 1972年， Carlson 利用烟草体细胞杂交获得再生植株。（无机盐法） 1974年， Kao 建立了聚乙二醇诱导融合技术； 1978年， Melchers 获得了第一个属间细胞杂种（番茄＋马铃薯）； 1981年，Zimmerman 发明了电融合仪，并首次提出了电融合概念； 1987年，Schweiger 建立了单对原生质体电融合技术程序。 一、概 述 2、研究进展： 早期的研究主要集中在茄科烟草属和番茄属，随后集中于十字花科拟南芥属和伞形科胡萝卜属，近来在禾本科、豆科及木本植物的体细胞杂交方面取得了很大的进展。 木本植物中柑桔最为成功。1975年柑桔原生质体培养成功。 1995年 Makankawkeyyoon 获得了含老鼠免疫球蛋白G的烟草植株（烟草-鼠杂交植物）。 一、概 述 3、研究意义 理论上说任何细胞，都可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。 融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。 体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。 二、原生质体融合技术 二、原生质体融合技术 （一）. 融合 化学诱导法 ：NaNO3融合法 1970年Power 介导了玉米、燕麦间原生质体的融合（ 效率不高） 高pH、高Ca2+法 Keller 烟草原生质体融合（毒害作用） 聚乙二醇（PEG）法 Kao 1974年建立 物理方法：电融合法 生物学方法：灭活的仙台病毒介导 1、聚乙二醇（PEG）法 乙二醇：HO-CH2-CH2-OH 聚乙二淳：HOCH2 -（CH2-O-CH2）n-CH2OH 用于诱导细胞融合的聚乙二醇的分子量为1500~7500之间，一般为6000。 诱导融合的原理及实验操作技术。 （1）、聚乙二醇（PEG）法 ②、原理： 原生质体融合时细胞间必须紧密接触（质膜间的距离小于10?），但正常原生质体表面带负电荷而相互排斥。 PEG可增加膜的流动性，并以自身带负电荷的醚键与带正电的水、蛋白质相互作用形成氢键介导原生质体黏连。 洗涤：打破了原生质体表面的电荷平衡，使某些原生质体的正电荷与另一些原生质体的负电荷相互作用而促进原生质体融合。 1、聚乙二醇（PEG）法 1、聚乙二醇（PEG）法 ①、融合液： 融合液A：CaCl2·2H2O（2~8mmol/L） 融合液B： CaCl2·2H2O（10~100mmol/L） KH2PO4 KH2PO4 甘露醇（山梨醇） 甘露醇（山梨醇） PEG(50%) pH （5.8） pH （7.0~10.0） 融合液A 过滤灭菌，融合液B 高温灭菌。 1、聚乙二醇（PEG）法 （2）、融合操作技术： ②、原生质体的密度和比例 两亲本原生质体的密度：1.0 × 105个/ml 比例：1：1混合 PEG法融合操作技术 1、聚乙二醇（PEG）法 （3）、PEG法融合技术的特点： 融合频率高 ，可重复性好 诱发融合无特异性： 植物+植物；植物+动物；动物+酵母 毒性