免疫检测技术教学课件-实验一 克伦特罗直接竞争ELISA检测实验指导.pdfVIP

实验一 克伦特罗(瘦肉精)直接竞争ELISA 检测 克伦特罗（clenbuterol ），化学名为4-氨基-α-[ (叔丁胺基) 甲基]-3,5-二氯苯甲 醇盐酸盐，属于β-兴奋剂（β-Agonist ）的一种。由于克伦特罗能显著降低胴体脂 肪含量，提高瘦肉率和增加瘦肉产量（由此得名“瘦肉精”），曾在畜牧业上作为 生长促进剂被广泛使用。克伦特罗有较大的毒性，当人们食用高残留克伦特罗的 动物性食品时，会出现心悸、头疼、目眩、恶心、呕吐、发烧、颤栗、神经过敏、 血管扩张、心率加快、肌肉震颤等中毒症状。因此，欧美等国早已禁止克伦特罗 在畜牧生产上的应用，我国农业部于1997 年3 月发布[农牧发(1997)]3 号文件， 禁止克伦特罗在动物生产中的应用。1999 年再次发布文件，禁止其使用，并规 定了在动物组织中的最高限量。然而，由于经济利益的驱使，克伦特罗违法滥用 的现象仍然较为普遍，中毒现象屡屡发生。 图1 克伦特罗分子结构式 检测克伦特罗的方法主要有高效液相色谱法（HPLC ），气相色谱－质谱法 （GC-MS），毛细管区带电泳法（CE ）和免疫分析技术（IA）等等。HPLC 法与GC-MS 法是克伦特罗残留检测的确证方法，其优点是检测精确度高，但因其仪器化程度 高、检测时间长、过程繁琐、检测费用昂贵等而阻碍其推广应用，而酶联免疫分 析（ELISA）快速检测技术因成本低、操作简单、速度快、一次检测样本量大、 仪器化程度低，现已成为常用的筛选方法。 1 实验原理 在微孔条上预包被偶联抗原；加入样品或标准品，样品或标准品中的克伦特 罗与微孔条上预包被的偶联抗原竞争结合酶标记的克伦特罗单克隆抗体，游离的 1 酶标记抗体通过洗涤被除去；再加入显色液，结合的酶标记抗体使无色的显色液 转化为蓝色，加入反应终止液后再转变为黄色，在 450nm 处测量，样品吸光值 与样品中克伦特罗含量成负相关，通过标准曲线即可计算出样品中克伦特罗含量。 检测原理示意图如下所示： ①未包被酶标板 ②将包被抗原包被在酶标板上 ③首先将标准品或待检样品加入到包被好的 酶标板微空内 ④然后加入辣根过氧化物酶标记的抗体，孵 育期间包被抗原与样品中的被检药物将同时 竞争酶标抗体，如果样品中的被检药物含量多 则与包被抗原结合的酶标抗体就少，反之就多 ⑤通过洗涤将反应液中未与包被抗原结合的 酶标抗体去除 ⑥加入底物缓冲液与底物液的混合液，酶标 抗体上辣根过氧化物酶将催化底物进行显色 反应（由无色变为蓝色） ⑦达到显色时间后，加入硫酸溶液终止酶促 反应，同时反应溶液由蓝色变为金黄色，此反 应液可通过酶标仪在450nm 波长下测定吸光 度值，从而通过软件计算得到待检药物的浓度 2 2 实验材料 （1）克伦特罗ELISA 试剂盒：百睿或其他同类产品。试剂盒包含如下试剂： 酶标记物（绿盖）1 瓶 3,3’5,5’- 四甲基联苯胺 （TMB ）底物液（黑盖）1 瓶 底物缓冲液（白盖）1 瓶 终止液（黄盖）1 瓶 浓缩洗液（透明白盖）1 瓶 0μg/L克伦特罗标准溶液（红盖）1 瓶 0.1μg/L克伦特罗标准溶液（红盖）1 瓶 0.3μg/L克伦特罗标准溶液（红盖）1 瓶 0.9μg/L克伦特罗标准溶液（红盖）1 瓶 2.7μg/L克伦特罗标准溶液（红盖）1 瓶 8.1μg/L克伦特罗标准溶液（红盖）1 瓶 包被偶联抗原的96 孔酶标板（12 条8 孔可拆酶标条）1 块 塑料封口袋1 个内装干燥剂1 袋 （2 ）微量移液器：100 或 200 μL （3 ）水浴锅或烘箱：保温，可选。 （4 ）酶标仪：MK-13 或同类仪器。 （5 ）洗瓶：500 mL，手洗时盛装洗液。 （6 ）吸水纸：吸干板条残留液体。 （7 ）样本：尿液或组织样品或饲料样品。 （8 ）蒸馏水。 （9 ）洗板机