肺癌血清蛋白质组学研究中高丰度蛋白质的去除及径HPLC分离后的谱图分析.pdfVIP

摘要 肺癌血清蛋白质组学研究中高丰度蛋白质的去除 及经HPLC分离后的谱图分析 摘要 血清蛋白质组学是蛋白质组学研究中的重要分支，在蛋白质组学的众多的研 究对象中，由于血清蛋白质所具有的独特的性质、重要的生理生化功能及研究意 义，因此长期以来一直是人们研究的热点。本课题旨在建立血清蛋白质组学研究 Abundant 中去除高丰度蛋白质(High Proteins，HAP)的方法，然后在此基础上 建立高效液相色谱指纹图谱方法学并探讨其在肺癌研究中的初步应用。 本实验进行了血清蛋白质组学研究中离心超滤法去除血清大分子量高丰度 蛋白质的研究。实验中将非小细胞肺癌患者血清与20％(v／v)乙腈以体积比1： 4混合，将混合后的血清分别加入截留标准分子量(molecularweight 15min，滤液真空冷冻干燥后，以超纯水按浓缩10倍复溶，分别应用 liquid Tricine．SDS—PAGE和二元梯度高效液相色谱法(Highperformance 分子量高丰度蛋白质条带明显变窄，而且明显看出随着膜孔径的减小，保留的蛋 白质的分子量也跟着降低。且经离心超滤后，HPLC检测结果显示，选用MWCO Abundant 为50，000的超滤管分离后，血清低丰度蛋白质(LowProteins，LAP)分 离良好，信息量保留较多，进一步研究其重复性，相对保留时间和相对峰面积的 standard 相对标准偏差(relative 滤法去除血清中大分子量HAP步骤简便同时兼有富集小分子量L垤的效果。 本实验建立了血清蛋白质组学研究中去除血清清蛋白的乙腈沉淀技术。血清 经除脂后按血清：水：乙腈=1：2：4．5(v／v／v)比例沉淀分离高丰度清蛋白，应用 SDS．PAGE验证去除效果和重复性，并分别对4名健康体检者和非小细胞肺癌患 者去除清蛋白前后的凝胶电泳图像进行分析，最后将同一份非小细胞肺癌患者血 清与健康体检者血清同时分别应用离心超滤和乙腈沉淀处理，并应用HPLC分离 处理后的血清。结果显示经本法去除后，血清清蛋白平均浓度由50．65±2．82g／L 下降为2．50±O．71 g／L，占血清总蛋白比例由65．1％下降为33．3％，去除前后相比 有明显差异(PO．01)。与等量上样原血清电泳结果相比，相对分子量80，000以 摘要 上的大分子量蛋白被去除，清蛋白条带明显变窄，而被其掩盖的LAP得以显现， 分别对4名健康体检者和非小细胞肺癌患者去除清蛋白前后的凝胶电泳图像进 行分析结果显示方法重复性良好，对比经两种方法处理血清的HPLC谱图发现乙 腈沉淀法在去除大分子量HAP的同时不影响小分子量LAP的保留，而且与离心 超滤法相比可以保留更多蛋白质峰。为血清蛋白质组学的进一步深入研究提供了 一种经济、简便的血清清蛋白去除方法。 实验进一步建立了血清蛋白质组学研究中HPLC指纹图谱方法学，对流动相、 柱温、检测波长、共有峰及内标的选择问题进行了研究，并以相对保留时间和相 对峰面积为参数分析了方法的重复性、稳定性、精密度。结果显示，在所建立的 条件下，内标峰的色谱保留时间约为23分钟，峰型清晰对称，与样品中的其他 蛋白分离完全。在健康对照组色谱图中，筛选出11个共有峰，以相对峰面积为 参数分析了方法的重复性、稳定性、精密度，其相对标准偏差分别5．64％、 4．79％、Q．94％，并初步发现健康体检者与肺癌患者谱图存在差异。 最后在批量样本中验证了肺癌患者、肺炎患者、健康体检者经上述建立的 HPLC指纹图谱方法分离后的谱图差异。选取性别年龄与肺癌患者匹配的41例 健康体检者及14例肺炎患者，非小细胞肺癌患者并排除其他疾病患者50例，应 用乙腈沉淀技术去除血清清蛋白等HAP后，并应用RP．HPLC技术进行分离小分 摘要 Abstrac