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pRI 系列RNA 干扰载体说明书 用于哺乳动物细胞RNA 干扰实验 Version 1.4 本说明书适用于以下pRI RNAi 载体： 载体 货号 pRI-Basic V6405 pRI-GFP V6406 pRI-Neo V6407 pRI-GFP/Neo V6408 pRI-Hygro V6409 pRI-GFP/hygro V6410 北京英茂盛业生物科技有限公司 北京市海淀区温泉路45 号4 号楼 Tel ：010 Fax：010 Emai：order@ Web site： 产品说明书 产品资料 浓度： 100ng/μl 体积： 15μl 缓冲液： 10mM Tris-HCl pH8.0，1 mMEDTA 储存： -20℃ 保存 产品技术背景 pRI 系列载体是基于III 类RNA 聚合酶启动子：人类H1 启动子的专用于哺乳动物细胞RNA 干扰的载体。H1 启动子在哺乳动物细胞内合成类似siRNA 分子的小分子RNA。由于H1 启动子有精确的转录起始位点和终 止信号，H1 启动子转录产物精确生成人工设计的shRNA，shRNA 经过RISC 剪切后形成有2 个U 突出末端 的成熟siRNA 。由于H1 启动子对转录产物长度的严格限制，基本上杜绝了非特异性干扰片段的产生，将 载体转染细胞后对其它基因的影响降到最低。 pRI 系列载体已经成功用于多种哺乳动物细胞进行基因的RNA 干扰。本系列中含有新霉素抗性基因的载体 用于稳定表达siRNA，可以在更长时间内对基因表达抑制后的细胞功能和生理现象进行观察和分析。 插入寡核苷酸设计 pRI 系列载体的使用需要将人工设计的寡核苷酸片段插入 pRI 系列载体中特定的酶切位点之间，寡核苷酸 片段中包含了针对目标基因的mRNA 设计的长度为19nt 的干扰片段。 合成时需要化学合成正向和反向两条寡核苷酸。正、反向寡核苷酸退火后与载体连接，插入载体Xho I，BglII 位点之间，位于载体上 H1 启动子下游正确的位置上。连接后的载体转入哺乳动物细胞在 H1 启动子作用 下转录产生shRNA 。 1、选择干扰序列。在RNA 干扰实验中，RNA 干扰序列的选择会显著影响RNA 干扰效果。我们建议您按照 以下几点指导原则选择RNA 干扰序列：  推荐长度为19nt，采用21nt 序列也可以取得良好效果。  RNA 干扰序列中不包含大于3nt 的连续相同碱基。  RNA 干扰序列的GC 含量为低到中等水平（推荐GC 含量在35%到50%之间）。  不要将RNA 干扰序列设计在已知的RNA-蛋白质结合位置附近。  确保RNA 干扰序列与其它基因没有较高的同源性。  方向：在编码mRNA 的正义链上选择RNA 干扰序列。 设计RNA 干扰序列是RNAi 实验的关键。这里提供的设计原则可以为您 设计RNA 干扰序列提供帮助。但是，值得注意的是，遵循这些原则不 能确保设计的RNA 干扰序列对目标基因有好的抑制效果。针对一个目 标基因，我们建议您至少设计 3 条干扰序列并且从中筛选出干扰效果 好的序列。 1 北京英茂盛业生物科技有限公司 Tel: 010 Fax: 010 Email: order@ 产品说明书 2、寡核苷酸设计。 （1）设计正义寡核苷酸链 （5’-3 ’方向）。 a) 5 ’TCGACCC b) 1