芯片技术的应用.ppt

基因芯片技术及临床应用;一.概述;然而如何充分利用新序列信息资源，怎样去研究如此众多基因的生物信息及其在生命过程中所担负的功能，成为生命科学工作者的共同课题。;已建立的诸如Northern印迹、RNA酶保护实验、S1核酸酶分析、噬斑杂交以及狭线印迹等方法不能提供足够通量来有效地利用新的基因组学的资源。为此，必须发展高通量或平行监测基因表达的新方法。 基因芯片技术正是在这样的背景下应运而生。;早在80年代初期，有人就曾设想利用计算机半导体技术生产基因芯片以对人类基因大量的遗传信息进行分析和检查。;但直到1994 年Pease等人创造的光导原位合成高密、微化的寡核苷酸阵列(ODTA)的制作技术问世之后，才使该设想逐步成为现实。;现在全世界已有十多家公司从事基因芯片研究和开发工作，而且已有较为成型的产品和设备问世。这些公司主要以美国的Affymetrix公司为代表。;二.基因芯片的定义;三.基因芯片相关技术及其进展;10;1.基因芯片的主要类型;基因芯片的主要类型及其简要特点;2.基因芯片的制备;原位合成 直接在芯片上用四种核苷酸合成所需的探针 合成点样 将已经合成好的探针定位在芯片上;原位光刻合成;把玻璃基片上的活性羟基修饰上光保护基团，此光保护基团可被一定波长的光激活并脱保护。 根据所要制作的阵列的需要设计光刻掩膜。将掩膜（M1）覆盖在修饰过的基片上，用光照射使曝光区域的基片表面脱除保护基团而形成活性羟基（1-2）。;引入5`端被X基团保护、3`端被活化的单核苷酸dNTP，使dNTP的3`端与基片上的活性羟基缩合，洗去未有效结合的dNTP（3）。 更换掩膜M2，重复1-2，直到所需要的探针阵列合成完毕（4-6）。;使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列，在合成循环中探针数目呈指数增长。 某一含ｎ个核苷酸的寡聚核苷酸，通过4×n个化学步骤能合成出4n个可能结构。;原位喷印合成;分子印章多次压印合成法;256*256分子印章阵列显微图?（0.18%) ;采用了平面微细加工技术，可实现大批量生产。通过提高集成度，降低单个芯片的成本 可组装大量的（104--106种）生物分子探针，获取信息量大，效率高，特别适合于基因???息的采集。 结合微机械技术（MEMS），可把生物样品的预处理，基因物质的提取，扩增，以及杂交后的信息检测相集成，制备成微物芯片。;高密度——分辨率高 准确性——合成产率高 一致性——工艺最优化 批量化——平面印刷法;合成点样;是将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。 目前，除Affymetrix等研究和生产基因芯片的少数大公司使用原位合成外，其他中小型公司和实验室研究中仍然普遍采用合成点样法。 ;微型机械点样法;通过毛细作用使用点样针将生化物质转移到固体基底表面（点样针与基底表面接触）。 第一轮结束后，清洗点样针进行下一轮操作。 机器人控制系统可使其实现自动化生产。;化学喷射法;用与压电接口（方型）相连的微型喷嘴将生化物质喷向基底，通过电流控制使样品体积得到精确控制。 第一轮结束后，清洗喷嘴进行下一步。;芯片制作工艺的进展;将样品处理、芯片杂交和信号检测集于一体的所谓“缩微实验室”逐渐成为基因芯片发展的新趋势。在这方面主要有以下技术较为成功：;电子芯片;Picture from Nanogne website: /;三维芯片;凝胶条的三维化能加进更多的已知物质，增加了敏感性。 可以在芯片上同时进行扩增与检测。 是该技术不仅可以用于基因芯片，也可以制作蛋白芯片。;流过式芯片;从待测样品中分离DNA或RNA并对其进行荧光标记。 将标记的靶核酸样品流过芯片，固定在芯片上微通道内的寡核苷酸探针捕获与之相互补的靶核酸。;特点 敏感性高，由于寡核苷酸吸咐表面的增大，流过式芯片可监测稀有基因表达的变化。 速度快，微通道加速了杂交反应，减少了每次检测所需时间。 价格降低，由于采用了特殊的共价化学技术将寡核苷酸吸咐于微通道内，使每一种流过式芯片可反复使用多次，从而使其成本降低。;3.靶基因样品的制备;3.1 靶基因的制备;宾夕法尼亚大学的研究小组针对人白细胞的分离设计的一种核酸样品制备方法。 微过滤芯片是通过在硅片上刻出几个微米大小的各种形状的过滤微通道，再在硅芯片上加上一块玻璃盖片而成。 发展经历了竖式Z型结构、竖式条状梳式结构到最终的横坝式结构。 ;为了把不同的癌细胞、细菌或病毒从血清、水样或其他液体样品中分离而设计的用作介电电泳的细胞分离方法。;美国的Nanogen公司通过在微过滤芯片的电极上施加一系列高压脉冲对电极上分离得到的大肠杆菌细胞进行进行电子胞解，获得了大肠杆菌细胞内的各种RNA和DNA。;3.2 靶基因的扩增与标记;4.靶基因的杂交及其信号检测;4.1 荧光显影法;