2型腺相关病毒重组绿色荧光蛋白转染体外培养神经干.docVIP

　　2型腺相关病毒重组绿色荧光蛋白转染体外培养神经干 【摘要】 目的 探讨2型重组腺相关病毒（rebinant adeno-associated virus 2, rAAV-2）载体能否有效地转染NSCs。方法 采用含有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）报告基因的rAAV-2（rAAV-2/EGFP），以感染复数（multiplicity of infection, MOI）分别为1×104、1×105、1×106转染体外分离、培养的大鼠胎鼠NSCs，在荧光显微镜下观察EGFP的表达；同时检测子代细胞的活力、增殖倍数、分化情况来评估对其存活、增殖、分化能力的影响；当EGFP表达稳定后，流式细胞仪检测rAAV-2/EGFP对NSCs的转染效率。结果 转染10天后各转染组便可观察到NSCs克隆球发出绿色荧光，起始荧光强度不一，随MOI值的增大而增强；各转染组荧光强度随时间的延长而逐渐增强，至转染21天后达高峰并维持，此时流式细胞仪检测rAAV-2对NSCs的转染效率：MOI为1×104、1×105、1×106时转染率分别为25.68%、50.60%、54.72%, 荧光指数（FI）分别为4.08、12.72、14.06；转染组和未转染组细胞培养7、14、21天时其细胞活力、增殖倍数、分化差异均无显著性。结论 rAAV-2能有效地转染NSCs，所介导的目的基因能高效表达。 【关键词】 神经干细胞；2型腺相关病毒；转染；感染复数；绿色荧光蛋白；荧光指数；细胞活力 【Abstract】 Objective To investigate the transfection efficiency of rebinant adeno-associated virus 2 （rAAV-2） in cultured neural stem cells.Methods The neural stem cells of rat embryo cultured, indentified in vitro ultiplicity of infection（MOI=0,1×104,1×105,1×106 ）. After transfection, the expression of EGFP icroscope. At the same time, the cytotoxicity of rAAV-2 to NSCs eter.Results EGFP cells-drived neurosphere of all transfected groups 10d follo cells efficiently, and the rAAV-mediated transfer of the gene can be expressed in the NSCs. 【Key cells；rebinant associated adeno virus 2; transfection; multiplicity of infection; green fluorescent protein; fluorescent index；cell vitality 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因是一种新的报告基因，由于其表达产物GFP可被直接激发产生荧光，不需要任何底物或辅助因子，较传统的标记基因如β2-半乳糖苷酶基因、荧光素酶基因等更具有明显的优越性；在GFP的基础上进行F64L和S65T的突变从而形成增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP），EGFP增强了GFP的荧光性能，更容易观察、检测［1］。2型腺相关病毒具有与人类疾病无相关性、宿主范围广、可整合入细胞染色体DNA介导外源基因长期表达等优点,是较理想的基因载体［2］。随着神经干细胞（neural stem cells，NSCs）的分离、培养、纯化及生物学功能研究深入［3～5］，寻找NSCs基因修饰载体及标记分子，已成为研究NSCs在体内、外分化调控和细胞工程基因治疗中枢系统疾病的研究热点。运用基因修饰神经干细胞治疗中枢系统疾病具有细胞修复和转基因治疗的双重优势。理想的基因转移载体是基因修饰的关键。 1 材料与方法 1.1 病毒载体 rAAV-2/EGFP购于863生物领域病毒基因载体研究开发基地、北京本元正阳基因技术股份有限公司，滴度为5×1011v.g/ml。 1.2 神经干细胞分离、培养、鉴定［6］ 按箱、超净台、流式细胞仪（BD）。 1.4 rAAV-2/EGFP体外转染神经干细胞 1.4.1 分组 取生长良好的NSCs，