Fascin基因在骨肉瘤中的表达及统计分析.docVIP

　　Fascin基因在骨肉瘤中的表达及统计分析 【摘要】 目的：探讨Fascin基因在骨肉瘤组织中的表达及及统计分析。方法 ：收集武汉市四大三级甲医院的骨肉瘤20例及良性骨软骨瘤5例,将实验分为骨肉瘤组(n=20)和良性骨软骨瘤组(n=5),采用免疫组织化学方法检测各组组织中Fascin基因的表达水平, 采用HPIAS 1000图文报告管理系统对Fascin基因的表达进行定量分析，并用SPSS11.5软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q)检验。结果：Fascin基因在骨肉瘤组织中呈高表达, Fascin基因在良性骨软骨瘤组织中呈低表达, Fascin基因在骨肉瘤组织中的表达与良性骨软骨瘤组织的表达比较差异有显著性(Plt;0.05)。结论：Fascin基因在肿瘤发生、生长、转移等过程中有促进作用，提示Fascin基因可能与骨肉瘤的发生、发展有关。 【关键词】 骨肉瘤; Fascin基因; 免疫组织化学; 图像分析; 统计分析 骨肉瘤是青春期正常骨骼快速生长相应发病高峰期最常见的原发性恶性肿瘤。其发生率约为0.1/10万, 其恶性度高，进展快，预后差，且以青少年好发。多发于10～20岁的青少年的长骨, 尤以股骨下段和胫骨上段多见[1]。占骨恶性肿瘤的20%左右,肺转移是其主要死亡原因,80%的病例在确诊时已有肺部微小转移灶。骨肉瘤早期临床症状无特异性,且病情进展较快,大多数病例就诊时已经进入临床ⅡB期[2～4]。Fascin基因属于fascins家族,其蛋白质编码产物是一种结构独特、进化保守的肌动蛋白( actin)交联蛋白,位于细胞膜皱褶、微棘及应力纤维,在各种转化细胞中促使细胞膜突起并增加细胞运动性。近年来的研究发现, fascin在许多恶性肿瘤组织细胞中表达上调,在恶性肿瘤的进展中起重要作用[5～7]。研究通过应用免疫组织化学方法和图像分析技术检测骨肉瘤及良性骨软骨瘤组织中fascin基因的表达水平，并进行了统计学分析，探讨Fascin基因在骨肉瘤发生、发展过程中的作用机制，为临床上防治骨肉瘤提供理论依据。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 材料及分组 收集武汉市四大三级甲医院病理科2000～2008年骨肉瘤存档蜡块20例及良性骨软骨瘤存档蜡块5例。所有切片经病理学专家诊断为骨肉瘤及良性骨软骨瘤。 　　1.1.2 材料 采用免疫组织化学SP法检测Fascin基因在骨肉瘤与良性骨软骨瘤组织中的表达。 　　1.2 主要试剂和仪器 　　1.2.1 主要试剂 　　①Fascin兔抗人多克隆抗体(北京中山生物技术有限公司);②超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒(福州迈新公司);③DAB显色试盒及多聚赖氨酸(北京中山生物技术有限公司)。 　　1.2.2 主要仪器 ① Y PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;② 抗原修复(柠檬酸缓冲液微波抗原修复法)，室温自然冷却后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗5×3 min;③ 滴加3%过氧化氢，37℃湿盒孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;　　④ 正常羊血清37℃湿盒孵育10min以减少非特异性背景;⑤ 甩去多余血清，分别滴加一抗，4℃孵育过夜，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5 min;　　⑥ 滴加生物素标记的二抗37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;⑦ 滴加链霉素抗生物素蛋白过氧化物复合物37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;⑧ 滴加新鲜配置的DAB显色液显色，光镜下控制反应时间(约3～5 min)，自来水冲洗终止反应;　　⑨ 苏木素复染，流水冲洗，1%盐酸酒精分色数秒，流水冲洗，0.1%氨水返蓝;⑩ 梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片并镜检;用PBS代替一抗作为阴性对照组，购买的阳性片作为阳性对照组。 　　1.4 免疫组织化学结果判断 　　Fascin阳性染色为棕黄色颗粒，定位于细胞核和胞质内。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。采用HPIAS1000 高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对Fascin基因的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400) ,测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积,计算阳性面积率(阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。 　　1.5 统计学处理 　　数据以均数±标准差表示，用SPSS11. 5 软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均