辛伐他汀对H2O2诱导的心肌细胞凋亡的抑制作用研.docVIP

　　辛伐他汀对H2O2诱导的心肌细胞凋亡的抑制作用研 【摘要】 目的 研究辛伐他汀对H2O2诱导的心肌细胞凋亡的抑制作用并探讨其机制。方法 应用出生2～3 d的SD（Sprague-Daol/L，3 μmol/L，10 μmol/L辛伐他汀保护组。损伤组H2O20.2 mmol/L作用6 h。甲基四唑蓝比色法（MTT法）测定心肌细胞活力；ＰＩ－ＡＶ双染后，流式细胞分析仪测定细胞凋亡率；用ethods About 2～3 days old Sprague-Dayocytes ely control group, damage group(H2O2 0.2 mmol/L), damage+1 mol/L simvastatin group, damage+3 mol/L simvastatin group, and damage+10 mol/L simvastatin group. The activity of dehydrogenase in mito-chondria etry. Expression of caspase-3 of cardiomyocytes ined by G-CoA还原酶)抑制剂。辛伐他汀用于临床的最初目的是用来降低血脂，但是近来越来越多的研究发现辛伐他汀对心血管系统的保护作用不仅与降脂作用有关，而且还存在许多与降脂作用无关的其他机制，包括改善内皮细胞功能的紊乱，提高内皮源性一氧化氮合成酶(eNOS)的生物活性，抑制平滑肌细胞的增生，抗氧化作用，抗炎作用，逆转血管重构。本实验拟观察辛伐他汀对H2O2诱导的大鼠培养心肌细胞凋亡模型的影响,并初步探讨其机制。 1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 实验动物 Sprague-Daa公司。实验时在55 ℃温水浴中，将辛伐他汀溶于0.5 mL无水乙醇中,加入0.1 mol/L的NaOH 0.5 mL作用2 h。室温放置30 min使其成为钠盐。用HCl调pH7.2,用蒸馏水稀释为2 mmol/L，过滤。放入-20 ℃冰箱储存。 其余试剂为分析纯。 　　1.2 方法 　　1.2.1 原代新生大鼠心肌细胞培养 　　在无菌的条件下，取出生1～3 d的SD大鼠乳鼠，开胸取出心脏，用D-Hanks液冲洗3次后剪成约1 mm3大小的碎块，加入0.08%胰蛋白酶消化细胞，取消化完毕后的细胞，加入含15%小牛血清的DMEM培养基，及0.01的双抗液（含1×105 U/L青霉素，100 μg/mL链霉素）的培养基，吹打均匀后以1×109/L的密度接种于底面积25 mm2培养瓶，或0.5×109/L的密度接种于24孔培养板送入通以体积分数为5%CO2及95%空气的二氧化碳孵箱中培养［3］。 　　1.2.2 实验分组 　　常规培养心肌细胞48 h后,换液。为了减少血清中的成分对实验结果的影响，换液时更换含0.04%小牛血清的培养基。将每组用5个底面积为25 cm2的培养瓶，或者将一个24孔培养板分为5组。分组如下：（1）对照组：正常对照组；（2）H2O2损伤组：正常组＋H2O2 0.2 mmol/L；（3）辛伐他汀保护组：在损伤组的基础上分别加入辛伐他汀浓度为1 μmol/L，3 μmol/L，10 μmol/L。 作用时间：损伤组加入H2O2 0.2 mmol/L作用6 h;各保护组提前加入相应剂量辛伐他汀作用1 h，加入H2O2 0.2 mmol/L作用6 h。 　　1.2.3 培养心肌细胞活力的测定 　　原代培养心肌细胞，将细胞密度调至1×104 /mL,接种于96孔培养板，每6孔细胞一组，各组分别加入对应的干预药物作用。于测试前4 h,每孔加入2 mg/mL的MTT液（50 μL/孔）；于CO2孵箱中继续培养4 h后弃去培养液，每孔加入DMSO 0.15 mL,振荡10 min后，酶标仪检测各孔OD值（检测波长570 nm）。 　　1.2.4 PI／膜联蛋白V染色［4］ 　　将接种于培养瓶的心肌细胞，48 h换液，加药同上，加入终浓度为0.2 mmol/L的H2O2孵育6 h(正常组除外)，0.125%的胰酶消化细胞，吸弃胰酶，PBS轻轻吹成悬液，1 000 r/min离心10 min洗3次，200 μL Binding buffer，用Annexin-V-FITC（10 μL） / PI（5μL）双标记后做流式细胞仪分析。 　　1.2.5 caspase-3蛋白检测 　　采用免疫印迹法检测caspase-3蛋白，6孔板培养细胞用蛋白裂解液裂解、超声破碎，取上清液，变性。上样前测量样品中总蛋白含量，以8％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜，封闭后，加入一抗，稀释度为1∶1 000，4 ℃孵育过夜。二抗稀释度1∶500，用碱性磷酸酶试剂盒显色，结果经扫描输入计算机进