肌酸对3T3表皮细胞的毒性研究论文.pdfVIP

C15肌酸对3T3表皮细胞的毒性研究 王琳王坤肖盛元邓玉林+ 北京理工大学生命科学与技术学院北京100081 肌酸是一种普遍流行的能量增强剂。人们一直认为肌酸是安全有效的，但最近有报道指 出，怀疑个别举重摔跤运动员的猝死与其长期大量服用肌酸有关，认为短期服用肌酸不会影 响健康，但长期大量服用会对生物体造成一定的毒性伤害。本实验将不同剂量的肌酸与3T3 表皮细胞供培养，然后用MTF法测细胞存活率，同时用HPLC／MS的方法测细胞内外液中 SSAO的活性。结果表明肌酸町以升高3T3表皮细胞内外液的SSAO活性，并降低细胞存活率， 从细胞水平上论证了肌酸的毒性伤害。 l实验部分 1．1试剂和仪器 纯肌酸粉购自康比特威刨体育新技术发展有限公司。多巴胺购自Fluka公司。乙腈 1100LCMSD 为色谱纯，购自Fisher公司。其他试剂为分析纯。仪器为AgilentTr印MS。 1．2细胞培养 mill． 不同浓度肌酸培养后取培养基做为细胞外液，将挂壁细胞超声破碎后，17000g离心10 取上清做为细胞内液。 1．3Lc／璐测细胞内外液SSA0活性 ul的0．05 标准甲醛溶液中加入40mg多巴胺，在400 M磷酸盐缓冲液(pH6．8)中，37C 液反应体系为：25mM甲胺、60 心10min，取上清液过滤进样。 um，10％(v／v)乙腈／缓冲盐的流动 色谱条件：DiscoveryF5．sH柱4．6rain×250mm，5 uL。 相(pH4．O)，流速O．8ml／min，进样量20 质谱条件：检测器为MS，ESI源，正离子模式，一级质谱做全扫描，扫描范围160～220 m／z，提取m／z L／rain。 170的离子流色谱图。雾化气压力为30psi，干燥气流速为9 1．4埘T法测细胞存活率 挑选处于对数生长期的细胞经胰蛋白酶消化后离心，制成细胞悬液，浓度为2．5X105个／ml。 波长为570nm。 2实验结果 由图l可知，随着肌酸浓度的增加，3T3表皮细胞内外液SSAO活性均有所升高，其中 细胞内液中SSAO活性明显高于外液。MTr结果表明(见图2)肌酸与细胞培养4小时后， 率降为73．04％。 3讨论 高又可能引起一系列与之相关的并发症，对细胞造成一定的毒性伤害。同时，肌酸在很大程 度上影响细胞的存活，这也可能是其会造成毒性伤害的原因之一。在下一步的实验中，我们 将选取有效浓度的肌酸与细胞培养，并测其细胞凋亡率，更全面的对肌酸的细胞毒性进行论 证。 0．00 0．20 0．40 0．60 0．80 1．00 l-20 1．40 一一婴酸浓度(mg／m1)一…一一．、 图1细胞内外液中SSAO活性结粜 不同浓度的肌酸与3T3袭皮细胞供培养后取细胞内外液用HPLCJMS的方法测其SSAO活性． +4d时 1．OO 0．90 糌 蜒0．80 灶 0．70r 0．60一 O lO 15 20 肌酸浓度(mg／m1) 图2，Mrr法测细胞存活率结果 不同浓度的肌酸与3T3表皮细胞供培养后加入MTT(05rag／m1)37℃反应4小时，吸出孔内全都液体，加入DMSO溶液震荡10min