广州医科大学《临床免疫学检验》3-2.单克隆抗体制备2014.pptVIP

本章内容 单克隆抗体概念、特性、与多克隆抗体的异同点？ 杂交瘤技术的基本原理 杂交瘤细胞的克隆方法 单克隆抗体的制备流程和应用 概念 多克隆抗体（PcAb）：针对抗原不同表位的多个B淋巴细胞克隆产生的混合抗体 单克隆抗体（McAb）：只针对抗原单一表位的B淋巴细胞克隆产生的同源抗体 为何要使用单克隆抗体？ 一个抗原分子可能含有许多抗原表位 一个B细胞只会生产一种抗体 传统抗血清对相似抗原会有交叉反应性 一个抗原分子上常有许多表位 一个B细胞只会生产一种抗体 抗血清对相似抗原会有交叉反应性 抗血清和单克隆抗体制备 B细胞无法在培养基中生长 肿瘤细胞可在培养基中永久生长 肿瘤细胞可在培养基中永久生长：若把瘤细胞永久生长的特性，利用细胞融合技术导入可生产抗体的 B 细胞 中，则得到可在培养基中永久生长的 B 细胞株，即杂交瘤细胞株。? 杂交瘤技术制备单克隆抗体 杂交瘤技术的基本原理 杂交瘤技术是将能够产生抗体，但在体外不能进行无限繁殖的B淋巴细胞与能在体外进行无限繁殖，但不能产生抗体的骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞。这种杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性：既能够分泌特异性的抗体，又能够在体外长期繁殖。杂交瘤细胞经过筛选、克隆化培养后成为单个细胞克隆，分泌的抗体即为单克隆抗体。 亲本细胞的选择与制备 亲本细胞的选择与制备 免疫脾细胞：是经过抗原诱导活化的免疫细胞，具有分泌抗体的能力　 8-12周龄BALB/c小鼠 先以 目标抗原(如菌体) 免疫，抗原需加 佐剂(adjuvant）注入小鼠体内慢慢释出，诱使 B 细胞成熟增殖并生产抗体。 试采血 确定有抗体产生后，即可取出 脾脏以收集脾脏细胞(大多为B 细胞) 与骨髓瘤细胞进行 细胞融合。? 注意乳剂的生产要完全，可取小量滴入水中，震动后应该不会散去。 有人打开腹腔直接在脾脏注射抗原免疫。 但除非抗原来源困难或有其它目的，我们仍采用传统方法，因免疫反应的启动机制非常复杂，生物整体的免疫反应是最可靠的。 细胞融合 细胞DNA合成途经 HAT选择培养基 三种关键成分： 次黄嘌呤（hypoxanthine,H） 氨基蝶呤（aminopterin,A） 胸腺嘧啶（thymidine ，T） ◆是根据细胞内嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成途径设计的用于筛选杂交瘤细胞的特殊培养基。 叶酸参与DNA合成过程，而氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，能阻断该合成途径。 ◆ HAT培养基中含有叶酸拮抗剂-氨基蝶呤，故所有细胞DNA合成的主要途径均被阻断，只能通过替代途径合成。 ◆杂交瘤细胞从脾细胞中获得HGPRT，同时又继承了骨髓瘤细胞长期生长繁殖的特性，能够在HAT培养基中得以生存而被筛选出来。 筛选方法 初步筛选： 融合后马上以 HAT 培养，能活下来的都是 B 细胞与 NS-1 的正确融合细胞，但此时细胞的遗传背景尚未十分稳定。　 筛选特异性抗体： 并非所有 B 细胞都会产生我们所要的抗体，小鼠原先就存在许多 B 细胞株对抗一般疾病；因此要用 酶联免疫分析法 （ELISA）挑出特异性抗体 阳性杂交瘤细胞的克隆化 克隆化 从抗体阳性孔中分离出单个细胞进行培养，使之繁殖成单一细胞集落的过程。 有限稀释法：最常用的方法 显微操作法 荧光激活细胞分选法 软琼脂平板法 克隆化需至少进行3-5次 阳性杂交瘤细胞的冻存 目的：保证杂交瘤细胞不会因污染或过多传代变异丢失染色体而丧失功能。 冻存液：10%-90%小牛血清+10%二甲亚砜（DMSO），1X106-5X106/0.5 mL 逐步降温:-800C过夜,再放入液氮 单克隆抗体生产 小鼠体内诱生法：先向小鼠腹腔注射降植烷，一周后把挑选出来的杂交瘤细胞打入小鼠腹部，诱生肿瘤，然后以 针头 收集所产生的 腹水，通常可取得 15 mL 左右；腹水中的抗体浓度非常高，每 mL 可达数 mg。? 2)体外增量培养法： 把杂交瘤细胞在大型培养槽中培养，收集培养液上清即得抗体，但每 mL 只得约数 mg，浓度较腹水稀约一千倍。最近有一种细胞培养瓶，可产生如腹水般浓度的上清，但价格极为昂贵 (IBS Integra Bioscience: Integra Celline)。 单克隆抗体的性质鉴定 Ig类型测定 特异性测定 效价测定 结合表位测定 亲和力测定 染色体分析 单克隆抗体的特性 高度特异性 高度的均一性和可重复性 弱凝集反应和不呈现沉淀反应 对环境敏感性 思考题 常用的细胞破碎方法有哪些？ 何谓佐剂？主要的作用机制有哪些？福氏佐剂的组成？ 什么是抗血清？制备的基本流程？单价特异性抗血清？ 何谓