广州医科大学《临床免疫学检验》16、17细胞因子和细胞黏.pptVIP

细胞因子及其受体的检测 临床免疫检教研室 细胞因子(cytokine)的基本特征 天然细胞因子是一类具有多种生物学功能的小分子活性物质，多数为蛋白质/糖蛋白/多肽，由免疫细胞或者非免疫细胞在接受外界刺激的情况下分泌。 分子量介于6,000-60,000D。 通常情况下，细胞因子极少储存，即不以前体形式贮存在细胞内，而是经过适当刺激后迅速合成，一旦合成后便分泌至细胞外以发挥生物学作用，刺激消失后合成亦较快地停止并被迅速降解。 细胞因子需与靶细胞上的高亲和力受体特异结合后才发挥生物学效应。 细胞因子在pM(10-12M)水平就能发挥显著的生物学效应。这与细胞因子与靶细胞表面特异性受体之间亲和力极高有关，其解离常数在10-12～10-10M之间。 主要参与免疫反应和炎症反应 影响反应的强度和持续时间的长短。涉及到感染免疫、肿瘤免疫、自身免疫、移植免疫等诸多方面。 某种细胞因子对靶细胞作用的强弱取决于细胞因子的局部浓度，大多是在近距离发挥局部作用 ； 存在着高效性/多效性/重叠性/协同性/拮抗性等特点； 细胞因子的作用并不是孤立存在的，它们之间通过合成分泌的相互调节，受体表达的相互调控、生物学效应的相互影响而组成细胞因子网络也可以取得协同效应，甚至取得两种细胞因子单用时所不具有的新的独特的效应。 细胞因子(cytokine)的分类 1、造血素家族（hematopoietin family） 白细胞介素（IL）, 集落刺激因子（CSF） 2、干扰素家族（interferon family） IFN-α/β/γ 3、肿瘤坏死因子家族（tumor necrosis factor family） TNF- α /β 、FasL、TRAIL 4、趋化因子家族（chemokine family） 细胞因子的生成和功能 细胞因子的作用方式 细胞因子的功能特点 1、多效性 2、重叠性 3、协同性 4、拮抗性 5、级联效应 细胞因子的测定方法 一、蛋白质水平 1、生物学测定法： 活性单位 2、免疫学测定法： 质量单位 二、基因水平 1、分子生物学测定法： DNA/RNA水平 生物学测定法的基本类型 一、细胞增生法 1.基本原理： 细胞因子促细胞生长、分裂。 2. 指示细胞 依赖细胞株:依赖于某一细胞因子而存活，且在一 定浓度范围内与细胞增生呈正相关。 3. 基本步骤 制备依赖细胞株 空白对照/加入标准品/待测样品 共培养，并检测 （H3-TdR渗入法、MTT比色法） 计算活性单位 H3-TdR渗入法：H3 标记的胸腺嘧啶核苷酸掺入新合成的DNA。 放射活性－每分钟脉冲数（CPM） MTT法：MTT被活细胞线粒体内酶氧化还原成不溶蓝紫色颗粒－甲瓒→DMSO溶解。 二、靶细胞杀伤或抑制法 1. 基本原理： 细胞因子的细胞毒性。肿瘤坏死因子 家族（TNF-α/β,TRAIL,FasL） 2. 敏感细胞株 3、基本步骤 制备敏感细胞株 空白对照/加入标准品/待测样品 共培养，并检测 （计算死细胞或者活细胞） 计算活性单位 51Cr释放法：首先用51Cr标记敏感细胞→＋细胞因子共培养→检测释放到培养基中的51Cr 结晶紫染色法：专染活细胞→脱色液洗脱→特定波长吸光度变化 三、细胞病变抑制法 1、基本原理 根据干扰素的抗病毒特性，将细胞、病毒、 IFN置同一培养体系中，细胞病变程度同IFN的 活性成反比。 2、指示细胞和病毒 3、基本步骤 制备指示细胞和病毒 空白对照/加入标准品/待测样品 共培养，并检测 （镜检或者MTT法/结晶紫染色法定量） 计算活性单位 四、趋化因子测定法 1、基本原理 趋化因子能够以浓度依赖性的形式趋化免疫细胞定向运动。 利用Boyden小室，在下室加入IL-8或者待测样品及硝酸纤维素膜，上室加入中性粒细胞，共培养后检测中性粒细胞向下室迁移的程度。 计算迁移指数：实验组细胞/阴性组细胞；实验组