广州医科大学《临床免疫学检验》15.流式细胞术-本.pptVIP

流式细胞术 临床免疫教研室 1.流式细胞术的基本原理（掌握）； 2.流式细胞术的技术要点（掌握）； 3.流式细胞术的临床应用（了解）； 第一节、流式细胞术的基本原理 流式细胞仪（FCM, Flow cytometer） 是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、抗体技术为一体的新型高科技仪器。 流式细胞术 （FCM, Flow cytometry） 用流式细胞仪测量液相中的悬浮细胞或颗粒的一种现代分析技术，可在细胞保持完整的情况下，精确、快速地对流动中的单个细胞进行分子水平的多参数、定量分析，并可对特定群体进行分选。 流式细胞术的特点和分类 分析对象：单细胞悬液或生物颗粒； 分析/分选速度：快速，20/10万个/秒； 检测参数：多参数（两个散色光参数，多个荧光参数）； 检测结果：精度高，准确性好 应用：临床、科研 流式细胞术的检测范围 流式细胞术的基本工作原理 根据待测细胞的生物学特性或细胞生化成分，选择特定荧光染料或与荧光染料耦联的多/单克隆抗体标记细胞，以激光作为激发光源，利用显微荧光光度测定技术、光电技术以及计算机技术测定流动相中单个细胞受激后的光信号来分析细胞的物理、生化、免疫、分子生物等多种特性，并可根据某些特征进行细胞亚群分选。 流式细胞仪主要构成系统 流动室和液流驱动系统 光学系统 信号检测和数据分析系统 细胞分选系统 1.流动室和液流驱动系统 液流系统将单细胞悬液样本聚焦在光源的中心处。 鞘流技术： 1. 样本与鞘液未入管道时，边缘与中心速度一致。 2. 进入管道后，受管壁粘性阻力边缘速度下降，中心速度不变。 3. 在管道大约50倍直径距离处，鞘液中心速度与边缘速度达到稳定，形成稳定的层流。 4. 流体形成层流后，会产生流体聚焦效应，所有颗粒均被推至流速最快的液流中。 5. 颗粒以衡定的速度作匀速运动。 2.光学系统 1. 激发光源； 气冷式氩离子激光器 (488nm)、氦氖激光（633nm）、375nm近紫外激光 2. 光速成形器； 聚焦激光光束 3. 滤光片； 选择不同波长的荧光信号 激发光源 滤光片 长通滤光片（LP, long－pass filter） 短通滤光片（SP, short－pass filter） 带通滤光片（BP, band－pass filter） BP500/50 3.信号检测和数据分析系统 光电二极管 光电倍增管（PMT, photomultiplier tube） 4.细胞分选系统 液滴偏转技术 1. 超声振荡压电晶体片 2. 脉冲发生器产生充电脉冲 流式细胞仪的检测参数 1. 散色光信号 前向角散色光（FSC）: 入射激光的同向散射光信号,与细胞相对大小及其表面积相关。 侧向角散色光（ SSC）：入射激光90?角的散射光信号，与细胞粒度及细胞内相对复杂性相关。 2. 荧光信号：特异荧光，自发荧光 荧光素与特异抗体结合； 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强； 散色光信号 荧光信号 线性放大 DNA, RNA 含量 对数放大 细胞膜表面分子 定量流式细胞术（quantitative flow cytometry，QFCM） 利用浓度确定的荧光计数微球实现FCM的绝对定量分析。 液相芯片技术（liquid chip tech，LP） 流式微球阵列技术（cytometric beads array, CBA） 将流式检测技术和芯片技术相结合。 第二节、流式细胞术的技术要点 单细胞悬液 的制备 保存 选择荧光染料的基本原则 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发； 激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内； 荧光素光谱的重叠应当尽量减少； 荧光标记 标记方法 影响因素 流式细胞仪的校准和质量控制 1. 校准 用已知散射光和荧光强度的标准微球对光路、散射光灵敏度、荧光线性和灵敏度校准。 2. 质量控制 a. 样品制备： b. 对照设置：阴性对照、 阳性对照、同型对照、单阳对照 c. 室内质控： 同型对照（抗体）：与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的未免疫的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。 数据的采集 1. 光路校正； 2. 建立获取模版, 设定获取细胞总数； 3. 利用未染色细胞(阴性管)调整仪器PMT电压; 4.用同型对照调节本底染色背景； 5.用单染色的细胞(单阳管)调节仪器补偿； 6. 上样检测并采集数据； 分析数据 设门 (gating)： 1. 在细胞分布的散点图中指定一个区域，对其中的细胞进行单参数或多参数分析。 2. 在线设门、离线设门