广州医科大学《临床免疫学检验》14-1免疫细胞的分离与其数量检测技术.pptVIP

第十四章 免疫细胞的分离与检测 Separation and Assays of Immunocyte 免疫细胞 指参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞。 主要分为以下三类： 1、淋巴细胞：T细胞、B细胞、NK细胞 2、抗原提呈细胞：包括血液中单核细胞和各种组织中的巨噬细胞、树突细胞 3、其他细胞：包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、红细胞等。 单核细胞－巨噬细胞 粒细胞 免疫细胞的来源和分离目的 1、目前可以从外周血、骨髓、胸腺、脾脏、淋巴结、组织等部位 2、检测免疫细胞的数量和功能，评价机体免疫状态；用于临床治疗；免疫细胞的生物学研究等 免疫细胞的分离与纯化(掌握) 淋巴细胞的数量检测（熟悉） 外周血免疫细胞分离的步骤及目标 抗 凝 血 细胞分离基本原理 不同细胞密度不同 不同细胞表面生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同 白细胞的分离 一、自然沉降法 原理：利用红细胞与白细胞的沉降速度不同，红细胞自然沉降率较快，可用自然沉降法分出白细胞层和红细胞层。 外周血单个核细胞的分离-----密度梯度离心法 原理：外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，为此利用用一定的介质在管中形成单次密度梯度、连续或不连续的密度梯度，将细胞悬液置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层分离。 红细胞和多核白细胞密度较大，为1.092左右 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.076～1.090 血小板为1.030～1.035。 常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。  Ficoll分离液法 是一种单次密度梯度离心分离法 分层液：聚蔗糖－泛影葡胺分层液 主要成分：1、聚蔗糖（商品名为Ficoll），分子量为40kD，具有高密度、基本等渗、无毒性的特点。 2、泛影葡胺（urografin）：用以增加密度。 分离人外周血单个核细胞的分层液最佳密度为1.077±0.001 淋巴细胞的分离 一、红细胞的去除：低渗裂解法 二、血小板的去除：离心洗涤 三、单核细胞和粒细胞的去除 A、 Percoll分离液法（连续密度梯度离心） B、粘附贴壁去除法 C、吸附柱过滤法 D、羰基铁粉吞噬法 A、Percoll分离液法 是一种连续密度梯度离心分离法，用于纯化单核细胞和淋巴细胞。 主要成分：Percoll是一种经聚乙烯吡咯烷酮(PVP)处理的硅胶颗粒，对细胞无毒性。 原理：利用Percoll液经高速离心后形成一个连续密度梯度（分层液形成一个从管底到液面密度逐渐递减的连续密度梯度），从而将密度不等的细胞分离纯化。 B、粘附贴壁去除法 C、吸附柱过滤法 D、羰基铁粉吞噬法 T细胞和B细胞的分离 一、E花环分离法 原理：T细胞表面有特异性绵羊红细胞（SRBC）受体，因此T细胞能与绵羊红细胞结合形成一玫瑰花样的花环，称为E花环。 二、尼龙棉柱分离法 原理：本法利用B细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性，可将T和B细胞分开。 淋巴细胞亚群的分离 亲和板结合分离法 免疫磁珠分离法 补体细胞毒法 流式细胞仪分离法 一、亲和板结合分离法 利用淋巴细胞亚群有不同的表面标志物的特点加以选择性分离。 直接法：先将相应抗体结合于反应板上，再将细胞悬液加到反应板上，抗原阳性细胞便与相应抗体反应而被吸附。 间接法： 二、免疫磁珠分离法 免疫磁珠法分为正选法和负选法 正选法－磁珠结合的细胞就是所要分离获 得的细胞负选法－磁珠结合不需要的细胞，游离于 上清液的细胞为所需细胞 技术类型：直接法、间接法 三、补体细胞毒法 吞噬细胞的分离和收集 1、可通过Percoll梯度密度分离法：获取 人外周血中单核－巨噬细胞 2、斑蝥敷贴法：从人体组织液中获取较纯的巨噬细胞 3、从小鼠、大鼠、豚鼠等小动物获取巨噬细胞：腹腔注入石蜡油，3-4天后收获腹腔渗出液 分离细胞的保存及活力测定 （一）短期保存技术 将分离到的细胞用适量含10％～20％灭活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640或其他培养液稀释重悬，4度保存。 （二）长期冷冻保存技术 利用液氮深低温（－196℃）环境保存细胞 §冷冻保护剂：二甲亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO） 1、冻存细胞悬液 2、降温:两步降温法（慢速降温） －80℃低温冰箱过夜 －196℃液氮深低温保存 3、