CAEV p28蛋白的原核表达及CAEV感染山羊卵巢颗粒细胞的分析.pdfVIP

摘要 摘要 Arthritis 山羊关节炎．脑炎(Caprine Arthritis Virus，CAEV)引起的山羊的慢性传染病。CAE 关节炎．脑炎病毒(CaprineEncephalitis 的典型症状是山羊羔脑脊髓炎和成年山羊多发性关节炎、硬结性乳房炎以及间质性肺炎。该 病呈全球分布，英国、美国等发达国家更为严重，我国丁1982年进口种山羊时传入本病，该 病对山羊种群造成的经济损失是惨重的。但是目前，对该病的预防与控制仍是世界各国所面 临的难题。为了在我国更好地预防和控制本病的发生和流行，建立一种快速、简单、可靠的 检测CAEV的诊断方法，本试验在大肠杆菌中诱导表达了CAEV p28特异性蛋白，并用该蛋 白作抗原建立了间接ELISA检测方法，用该方法对100份本室保存血清进行了检测。 首先使用山羊关。肯滑膜细胞成功繁殖了山羊关节炎．脑炎病毒后，参照GenBank发表的 基冈序列，设计合成一对带有酶切忙点的引物，对CAEV甘肃株p28基因进行PCR扩增， 并进行了分子克隆，利用pET表达载体成功实现了p28基因在大肠杆菌中的表达。重组蛋白 氨基端带有6个组氨酸标签，利用固定化金属离子亲和层析法进行纯化，免疫印迹试验证明 该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。以纯化蛋白作为诊断抗原建立了间接ELISA诊断方 法．确定其晟佳J：作条件为重组抗原每孔包被0．1№．阳性血清以1：50倍稀释，辣根过氧化 间为2h，判定标准为P／N值人于2，且OD值在1．0左以的血清为阳性，否则判为阴性；同时 用纯化的p28蛋白免疫小鼠，制备阳性血清。利州重组蛋白抗原检测3只CAEV攻毒后山羊血 清抗体水平时发现，3只山羊均在接种2周后可产生p28蛋白的相应抗体，此抗体一直持续 试验结果对比中发现，攻毒山羊在接种5周后用两种方法都可检测到缸清抗体，但琼扩方法 检测到抗体的最早时间比ELISA方法检测到抗体的擐早时间要迟3周，而且琼扩方法在检测 攻毒后第6个月山羊血清时为阴性，而ELISA方法检测结果为阳性，一方面说明表达的p28 蛋白抗原性好，另一方面也说明用琼扩方法能够检测到的p28抗体水平要比ELISA方法能够 检测到的p28抗体水平高，ELISA诊断方法比琼扩诊断方法有高的敏感性。重组抗原在实际 应用中共检测100份血清样品，67份抗体检测旱阳性。 我们知道CAEV能够在山羊关节滑膜、胎肺、眼角膜细胞上繁殖，但展近国外有报道称： CAEV在山羊卵巢颗粒细胞上也能够繁殖，而且山羊卵巢颗粒细胞经常被用丁体外卵母细胞 成熟，同时几乎所有的工业化国家山羊种群都高度感染CAEV，而且许多不明来源的卵母细 胞被用作体外山羊胚胎生产，所以我廿J认为作为饲养层细胞的颗粒细胞可能是山羊胚胎感染 径提供一条新的线索。为此，本研究进行了CAEV在山羊卵巢颗粒细胞上的感染性试验。对 山羊卵巢颗粒细胞进行原代培养．传代2．3代以后，接种CAEV，观察细胞病变，提取病变 细胞核酸后，用设计好的的针对CAEV p28基因的引物进行PCR扩增。扩增山一条660bp的 片段，经过序列分析后，确定为p28基因，证明CAEV基因组己整合到颗粒细胞基因组上： 用上面试验中制各的p28蛋白免疫小鼠获得的阳性血清对病毒在颗粒细胞上的培养物进行 CAEV特异性蛋白的免疫印迹试验，发现培养物中有CAEV特异性p28蛋白，证实整合到颗 V 粒细胞基因组上的CAEV能表达CAEV特异性蛋白：又用颗粒细胞上繁殖的CAEV在山羊 关节滑膜细胞进行病毒滴定，结果TCID50值为10’‰蛐t示CAEV在山羊颗粒细胞上能够繁 殖，并释放出病毒粒子。 本试验在国内首次成功表达了CAEVp28基冈并建立了针对该蛋自的间接ELISA的诊断 方法。该诊断方法敏感、特异，为我国CAEV的诊断与监测提供了一种技术手段，并为该诊 断试剂盒的研制与开发奠定了前期基础。同时确定了起源于山羊卵泡的颗粒细胞对CAEV感 染非常敏感，这样在扩人培养高价值山羊时，体外受精和胚胎移植获得的山羊胚胎通过颗粒 细胞感染CAEV的几率增大。所以更应该对山羊种群