极大节旋藻（Arthrospira maxima）生物钟基因kaiC的克隆及分析.pdfVIP

维普资讯 刘 玮等：极大节旋藻(Arthrospiramaxima)~物钟基因kaiC的克隆及分析 极大节旋藻 (Arthrospiramaxima)生物钟基因kaiC的克隆及分析① 刘 玮② 茅云翔③ 凌 娜 王孟强 崔菁菁 (中国海洋大学海洋生命学院青岛市鱼山路5号 266003青岛) 摘 要 以kaiC基因簇部分已知序列为引物设计位点，采用PCR反应池法从节旋藻基因 组fosmid文库中筛选到 kaiC基因克隆，通过步移测序获得 了kaiC基因全长序列。kaiC 基因编码区长 1554bo，基因GC碱基含量平均为41．76％，密码子第三位 明显偏 向于U。 在基因上游385bp范围内发现一个可能的启动子序列和一些基因调控元件。KaiC蛋 白 分析发现了WalkerA、DXXG、不完整的WalkerB等重要模体和具有催化作用的功能位点。 Southem杂交的结果证明kaiC基因在极大节旋藻中为单拷贝。极大节旋藻kaiC基因的 特殊结构特征为研究kai基因簇的进化提供 了重要的启示。 关键词 节旋藻，生物钟基因，kaiC基因，分子进化 maxima)，是一种不产异形胞的丝状蓝藻，在分类上 0 引 言 属于蓝藻门、颤藻 目、颤藻科、节旋藻属。节旋藻不 生物钟也叫生物节律，指的是生物体的生理、行 仅营养丰富具有较高的经济价值，而且它具有耐高 为、形态结构等随外界环境做周期性变化的一种现 pH、耐高盐的生物特性，因此引起了人们的关注。 象。最初人们认为生物钟基因只存在于真核生物 目前蓝藻生物钟研究多集 中于单细胞蓝藻(聚球藻、 中，并把生物钟基因作为真核生物的一种重要特 集胞藻)和产异形胞丝状蓝藻(鱼腥藻、念珠藻)，而 征…1，直到20世纪 80年代才在原核生物蓝藻中发 针对不产异形胞丝状蓝藻的生物钟尚未见报道。因 现了生物节律的存在 【，随后的研究发现原核生物 此本文选取极大节旋藻 (Arthrospiramaxima)为研究 中也存在生物钟。蓝藻具有生物钟节律的现象 3【1不 对象，以进一步丰富蓝藻生物钟相关研究。 断受到人们的重视，许多研究发现蓝藻生物钟调控 1 材料与方法 着多种代谢途径和基因的表达，已知蓝藻的生物钟 调控的途径有固氮_4J、细胞分裂_5J和其他一些代谢 1．1 材料 过程[6,71，说明生物钟的调控作用是蓝藻 自身调控 极大节旋藻 FACHB438来 自中国科学院水生 的一种重要机制。 生物研究所淡水藻种库，其基因组 fosmid文库为本 蓝藻的生物钟基因最初在聚球藻(Synechococcus 实验构建，文库随机测序得到 kaiC基因片段。限制 sp．PCC7942)中发现 【，9l，其生物钟节律源于一个 性内切酶和 raq酶购 自大连宝生物公司，Southem 由 、 、kaiC组成的基因簇。核磁共振和晶 杂交使用的尼龙膜购 自德国boehringer公司，杂交试 体衍射解析确定了KaiA、KaiB、KaiC蛋 白的三维结 剂盒为 Roche公司的 DIGHighPrimeDNALabeling 构 【 J。酵母双杂交实验证明Kai蛋 白间可 以相互 andDetectionStarterKitI。 作用[17,掩]，电镜分析发现Kai蛋 白在生物体 内能够 1．2 PCR反应池筛选 目的克隆 形成以kaiC蛋 白六聚体