重组毕氏酵母中降解hIFNβ-HSA蛋白酶的鉴定及其活性控制.pdfVIP

Sep．2008 生 物 加 工 过 程 第6卷第5期 · 50 · ChineseJournalofBioprocessEngineering 2008年9月 重组毕 氏酵母 中降解 hIFN3／一HSA蛋 白酶 的鉴定及其活性控制 宋一丹 ，窦文芳 ，许泓瑜 ，金 坚。，陆茂林 ，许正宏 。 (1．江南大学 医药学院制药工程实验室，无锡 214122； 2．江苏省微生物研究所，无锡 214122； 3．江南大学 教育部工业生物技术重点实验室，无锡214122) 摘 要：研究了重组毕赤酵母KM71／pPIC9K—IFN3／一HSA表达融合蛋白hlFN3／一HSA过程 中产物降解的问题。十二烷 基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶 电泳(SDS—PAGE)和Western—Blotting分析结果表明，发酵液 中除了9．0X10的目的融合 蛋白hlFN3／一HSA外，同时还出现了6．5X10的降解带，进一步结合HPLC分析证 实该降解发生在融合蛋 白hlFN3／一 HSA的HSA区域。在此基础上，采用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶 电泳(SDS—PAGE)活性电泳的方法，确定在 融合蛋白hlFN3／一HSA表达的过程中，引起融合蛋白hlFNfi—HSA降解的蛋白酶为蛋白酶B(ProteinaseB，PrB)。最 后，确定了可以抑制融合蛋白hlFN3／一HSA降解的最佳的蛋 白酶抑制剂EDTA，通过在诱导表达阶段添加不同浓度 的蛋 白酶抑制剂EDTA，使融合蛋 白的表达量达到22．18mg／mL，与空白对照组相 比增加了61％。 关键词：毕赤酵母；蛋白酶；SDS—PAGE；高效液相色谱；人 3／干扰素一血清白融合蛋白；抑制剂 中图分类号：Q814．9 文献标志码：A 文章编号：1672—3678(2008)05—0050—05 Definition and characterizati0n ofproteaseoffusionhuman IFNfl-HSAexpressedinpichiapastoris SONGYi—dan ，DOUWen—fang ，XUHong—yu ，JIN Jian ，LUMao—lin ，XU Zheng—hong， (1．LaboratoryofPharmaceuticalEngineering，SchoolofMedicineandPharmaceuties，JiangnanUniversity，Wuxi，214122，China； 2．JiangsuInstituteofMicrobiology，Wuxi，214122，China； 3．KeyLaboratoryofIndustrialBioteehnology，MinistryofEducation，JiangnanUniversity，Wuxi，214122．China) Abstract：Theproblem fortheexpressionofrecombinanthumanIFNfi．HSAfusionproteininPichiapasto． risKM71／IH wasthedegradationofthetargetproteinsduringfermentation．TheanalysisbySDS．PAGE andWestern-blotshowedthat9．0 ×10 fusionproteinand6．5X10 degradationbandappeared in the fermentationbroth．ThedegradationappearedintheHSAregionofrecombinanthumanIFN／3．HSAfusion proteinwasconfirmedbyHPLC analysis．Theproteasecausedthedegradationoffusionprotein IFN8． HSA wasproteinaseB