细胞核蛋白 浆蛋白抽提试剂盒.pdfVIP

◆ 细胞核蛋白/浆蛋白抽提试剂盒 ◆ 目录号 1910 ◆ 使用手册 ◆ 实验室使用，仅用于体外  试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成 保存 50次(191001) Cytoplasmic Extraction Reagent A(CER A) 4°C. 10ml Cytoplasmic Extraction Reagent B(CER B) 4°C. 0.55ml Nuclear Extraction Reagent (NER) 4°C. 2.5ml 本产品常温运输，4°C 保存，至少12 个月内有效。  产品介绍： 细胞核蛋白/浆蛋白抽提试剂盒(Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提 供了一种简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提核蛋白与浆蛋白的方法。约90 分 钟就可以完成培养细胞的核蛋白与浆蛋白的分离。抽提得到的蛋白为非变性，有活性， 可以用于 Western 、EMSA 、footprinting、报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。 本试剂盒是通过细胞浆蛋白抽提试剂A 和B ，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀后 破坏细胞膜，释放出浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。最后通过高盐的细胞核 蛋白抽提试剂抽提得到核蛋白。本试剂盒可以抽提50 个，数量为2×106 个Hela 细胞（约 40mg）的样品。可根据需要按比例放大，缩小提取规模。  注意事项： 1. 需自备 PMSF ， PMSF 一定要在抽提试剂加入到样品前 2-3 分钟内加入，以免 PMSF 在水溶液中很快失效。 2. 抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4 ℃进行。 3. 对于组织样品，本试剂盒仅适合于新鲜组织，对冻存过的组织抽提效果差。可以 抽提的组织样品数通常不足50 个。 4. 使用本试剂盒抽提得到的细胞核蛋白与细胞浆蛋白都可以直接用博迈德生产的 BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。但不适合用Bradford 法测定蛋白浓度。  操作步骤： （实验前请先阅读注意事项）  准备溶液：室温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适 当量的CER A 备用，在需要加入前数分钟内加入PMSF 至终浓度为1mM 。取适 - 1 - 当量的NER 备用，在需要加入前数分钟内加入PMSF 至终浓度为1mM 。如果目 标蛋白含丰富的半胱氨酸，可在CER A 、NER 中加入DTT 至终浓度0.5mM 。 1. 对于贴壁细胞：用PBS 洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA 溶液处理细胞 使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打细胞(最好不用胰酶消化，因为可能降解蛋 白) 。500xg 离心2-3 分钟，尽可能吸弃上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰 酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。接步骤4 。 2. 对于悬浮细胞：用PBS 洗一遍，500xg 离心2-3 分钟，尽可能吸弃上清，留下细 胞沉淀备用。接步骤4 。 3. 对于新鲜组织： 1) 把组织尽可能切成非常细小的碎片。在PBS 里面匀浆制成细胞悬液，500xg 离心 2-3 分钟，弃上清，估计细胞沉淀体积，接步骤4 。 2) 把组织称重后，把组织尽可能切成非常细小的碎片，按照每50 毫克组织加入500 微升的比例加入CER A ，匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内，接步骤5 。在步 骤7 按照每200 微升CER A 加11 微升比例加入CER B 。 4. 每20 微升细胞沉淀加入200 微升添加了PMSF 的CER A 。(对于2×106 个Hela 细 胞，其细胞沉淀的体积大约为20 微升或40 毫克。) 5. 最高速剧烈Vortex 15 秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。(如果细胞沉淀没有完 全悬浮并分散开，可以适当延长Vortex 时间。) 6. 冰浴10-15 分钟。 7. 加入CER B 11 微升。最高速剧烈Vortex 5 秒，冰浴1 分钟。 8. 最高速剧烈Vortex 5 秒，4 ℃14,