4个鸡品种tpk1基因的pcr-sscp分析.ppt

4个鸡品种TPK1基因的PCR-SSCP分析 ——动科①班第二小组 TPK1 硫胺焦磷酸激酶 硫胺素（维生素B1）的一种衍生物 在肝细胞内由硫胺素受硫胺素焦磷酸激酶的催化被磷酸化而生成 PCR-SSCP是近年来在PCR技术基础上发展起来的一种分析突变基因的方法，是基于DNA构象差别来检测点突变的手段，现已广泛应用于遗传及恶性肿癌基因突变的分析上。 PCR-SSCP技术的原理： 序列不同的DNA单链片段，其空间构象亦有所不同（与该段DNA的碱基序列有关）；当其在非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，由于受排阻大小不同，其电泳的位置亦发生变化而表现出不同序列单链其电泳迁频率的差异，因此可以判断有无突变存在. PCR-SSCP实验流程 肉的风味主要包括哪两个方面？？？ —— 滋味: 来源于肉中的滋味呈味物质，如肌苷酸( IMP) 构成肌肉鲜味和香味的主要成分有两种： MP、硫胺素 硫胺素在体内的合成、代谢过程十分复杂, 从开始合成共涉及10多种关键酶。 硫胺焦磷酸激酶(TPK1)是硫胺素代谢过程中的关键酶之一。 关于硫胺焦磷酸激酶（TPK1）研究发现 曲霉菌TPK 1基因定位于7号染色体； 日本水稻TPK 1基因定位于1 号染色体； 狗TPK 1基因定位于16号染色体； 黑猩猩TPK 1基因定位于7号染色体； 人TPK 1基因定位于7号染色体的q34~ q35； ★鸡TPK 1基因被定位于2号染色体, 包含7个外显子。 外显子 真核生物基因的一部分，剪接后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。 外显子是最后出现在成熟RNA中的基因序列,又称表达序列。既存在于最初的转录产物中，也存在于成熟的RNA分子中的核苷酸序列。 术语外显子也指编码相应RNA外显子的DNA中的区域。 所有的外显子一同组成了遗传信息，该信息会体现在蛋白质上。 实验设计思路 候选基因: TPK1 材料: 隐性白羽鸡、泰和乌骨鸡、萧山鸡、白耳鸡 方法: 采用PCR-SSCP方法对TPK 1所有外显子及3’-调控区进行SNP筛查 目的: 探讨不同基因型与不同鸡品种肌肉硫胺素含量的关系 意义：从分子水平上探明我国地方鸡品种特异香味形成机理, 希望能为地方鸡品种肉品质的开发利用提供理论依据。 单核苷酸多态性是DNA序列上发生的单个核苷酸碱基之间的变异 5’ – GGATCAGTACTGACTCAG – 3’ 5’ – GGATCAGTAATGACTCAG – 3’ SNP变异来源 转换　transition 一种嘧啶置换另一种嘧啶　C?T 一种嘌呤置换另一种嘌呤　A?G 颠换　transversion 嘌呤与嘧啶互换，C?A，A?T等 缺失/插入 1、 材料与方法 1.1?? 供试动物及主要试剂 1.2?? 引物设计和PCR 扩增 1.3?? SSCP分析 1.4?? 测序 1.1 供试动物及主要试剂 苯酚/氯仿（酚/氯仿抽提法）提取DNA 利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性 SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解 在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。 DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。 1.2 引物设计和PCR 扩增 根据鸡的TPK1序列与鸡的全部基因组序列相比对, 采用Primer Prem ier 5..0、O ligo 6..0等引物设计软件, 共设计15对特异引物, 用于扩增TPK1基因的所有7个外显子及3’-调控区。 表1 引物核苷酸序列 PCR 反应程序: 94℃预变性5min ↓ 94℃变性50s ↓ 49~60℃退火50s ↓ 72℃延伸50s ↓ 72℃再延伸10min。 ↓ 反应产物于4℃保存 PCR仪 1.3 SSCP分析 5uLPCR产物中加入缓冲液5~6uL ↓ 98 ℃变性10min, 冰浴5min, 保持变性状态。 ↓ 变性后产物在10%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳, 150V电泳6~9h,银染显色。（硝酸银 ） 1.4 测序 根据PCR-SSCP分析结果, 选取不同基因型的纯合子(或杂合子)进行测序。 PCR产物经电泳鉴定后, 用胶回收试剂盒回收目标片段, 纯化后由上海生工生物工程公司测序。 2、 结果与分析 2.1 PCR-SSCP分析结果 2.2 序列分析结果 2.3 4个鸡品种TPK1基因的基因频率和基因型频率 2.4 4个鸡品种 TPK1基因不同基因型分布差异检验 2.1 PCR-SSCP分析结果 P15扩增的片段有5种基因型, 分别定义为AA、BB、AB、CC、AC 。 2.2序列分析结果 取AA、BB 和CC 3种基因型的