第三章聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称page).pdf

( PAGE) ( PAGE) 第三章 聚丙烯酰胺凝胶电泳 简称 (( PPAAGGEE)) 一、聚丙烯酰胺凝胶的特点 二、电泳的原理 SDS PAGE 三、电泳操作流程（SDS－PAGE） SSDDSS PPAAGGEE 四、电泳的应用 一、聚丙烯酰胺凝胶的特点 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交 联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N， N′′，N′′-四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸′′ ′′ 铵(简称AP)或核黄素(V )的作用下聚合交联成三维 B2 网状结构的凝胶。该凝胶具有刚性的凝胶孔，凝胶 孔径的大小主要决定于丙烯酰胺的浓度。 聚丙烯酰胺凝胶具有如下优点： � 一定浓度下，凝胶透明，有弹性，机械性能好 � 化学惰性好，在范围较大的pH、温度和离子强度等条件下 稳定；几乎无电渗作用 � 由于可以制得高纯度的单体原料 ，样品分离重复性较好 � －6 样品在凝胶中不易扩散，样品分离灵敏度高，可达10 g � 容易制备出孔径范围很宽的凝胶，以适应不同的需要 � 无紫外吸收，不染色就可以用于紫外波长的凝胶扫描作定 量分析 凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关 二、电泳的原理 1. 1. native PAGE 11.. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（native－PAGE） nnaattiivvee PPAAGGEE � 生物大分子在聚丙烯酰胺凝胶中泳动时，有电荷效应与分 子筛效应。不同的核酸或蛋白质，它们的分子量大小及构 型不同，所带净电荷的多少不同。电泳时的泳动率就不 同，从而分出不同的区带。在电泳分离后能保持蛋白质和 酶等生物大分子的生物活性。 分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的带电颗粒通过一 定孔径的凝胶时，因受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移 率，这就是分子筛效应。分子量小，阻力小，移动快；分子量 大，阻力大，移动慢。 电荷效应：带电颗粒由于所带电荷量不同，而在电泳中表现出 不同的迁移率，这就是电荷效应。 2. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 2. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 22.. SSDDSS--聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳（（SSDDSS--PPAAGGEE）） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引 ※ 进SDS（十二烷基磺酸钠）的一种电泳方法。 ※ SDS是阴离子去垢剂，它能断裂分子内和分子间氢键，破 坏蛋白质的二级和三级结构，而强还原剂能使半胱氨酸之 间的二硫键断裂。蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的 SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS- 蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白 质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征 的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天 然的电荷差异。因此，SDS－蛋白质复合物在凝胶中的迁 移率取决于蛋白质的分子大小。也就是说蛋白质分子在 SDS中只有分子筛效应。 根据各种PAGE有无浓缩效应，分为以下两类： 连续系统中：样品、凝胶、电极缓冲液的离子成