家畜传染病学实验指导：伪狂犬病的实验室诊断 免费.docVIP

实验十五 伪狂犬病的实验室诊断 目 的 熟悉伪狂犬病的实验室诊断方法。 内容及方法 一、病毒的分离培养 分离病毒的材料于发热期最好采取中脑、桥脑及延脑，或采取病患部之水肿液、侵入部神经干及脊髓。病料用培养液制成1：10组织悬浮液，经离心沉淀，取上清液皮下、肌肉或脑内接种家兔、大鼠等实验动物。家兔接种后约36～48h在接种部发生典型的奇痒症状；这种症状仅维持几小时，一般常于夜间死亡，从死兔口内可见有接种部位咬下的被毛。大鼠接种后出现的症状与家兔相似；与其他实验动物不同的是，当将病料给大鼠经口喂服时，可出现奇痒、唇部自残症状，并归于死亡。 应用9～11日龄鸡胚作绒毛尿囊膜接种，也是一种常用的病毒分离方法。感染鸡胚常可呈现特征性病变，如心、肝、脾增大；心包腔积液，液体混浊；肝、脾有大的坏死灶；皮肤和脑出血。在血管内皮细胞、脾基质细胞、肝的实质细胞和基质细胞．内，镜检可见到核内包涵体。 也可用细胞培养法来分离病毒。许多种哺乳动物细胞均能繁殖本病毒，但最常用的是猪肾传代细胞。兔、猪及牛肾原代细胞亦可用于分离病毒。病料接种细胞后，一般经48h出现病变，如病毒含量多，则可在18h出现病变，如病毒量低，要延迟到96h才出现病变。其典型的病变是出现巨细胞。部分病变细胞胞浆内颗粒增多，细胞肿大变圆，而不互相融合，渐渐萎缩坏死。此时将细胞培养物作苏木紫—伊红染色，镜检可发现嗜酸性核内包涵体。当细胞全面出现病变后渐自瓶壁脱落。自出现病变到整个细胞层破坏约经24～48h。 分离获得病毒以后，即可对病毒进行鉴定。除病毒的形态结构、理化学和培养特性检查外，要重点作病毒中和试验。应用已知标准毒株的免疫血清对新分离病毒做中和试验。采用常规的病毒稀释法或血清稀释法均可。将病毒—血清混合液置于37℃作用1～1.5h后，接种猪肾或兔肾细胞培养物，如能采用蚀斑减数法则更佳，不仅结果精确，而且还能根据蚀斑，直径大小，了解新分离毒株的毒力强弱情况。 二、特异性免疫荧光诊断法 对可疑病畜或接种动物的中枢神经系统如中脑、桥脑、延脑或脊髓作冰冻切片或压片，用免疫荧光直接法检查。阳性病例可见神经节细胞胞浆及核内均有荧光。感染的组织细胞亦可用此法来确定感染的病毒。 三、特异性抗体的检测 自然条件下，除猪以外，感染本病的其他动物均难以幸存，因此特异性抗体的检测主要用于猪。病毒中和试验可用来检测可疑猪血清内的特异性抗体。其法为选用一株伪狂犬病细胞适应毒，以每0.1ml病毒溶液中含有100TCID50。的稀释病毒与连续作2倍稀释的被检血清0.1ml混合，37℃培养1.5h，再接种于细胞培养物上。每个血清稀释度至少要接种4个细胞培养物，每个培养物接种0.2ml。试验时应设立阳性和阴性血清对照。病毒接种于细胞培养物后，37℃继续培养并观察细胞病变。判定结果，当相应管不出现细胞病变则血清就判为阳性，如果细胞病变不明显或比阴性血清对照管还少，或只在某些管中出现细胞病变应判为可疑(应重检一次)。如能使病毒的细胞病变被完全中和的血清最高稀释度的倒数来表示血清滴度。康复猪的血清常有1：8到1：64的中和能力。 复习题与作业 伪狂犬病的实验室诊断以哪种方法最简便而可靠？