家畜传染病学实验指导：口蹄疫的实验室诊断.docVIP

实验十六 口蹄疫的实验室诊断 目 的 初步掌握口蹄疫的反向间接红细胞凝集试验，补体结合试验，琼脂扩散试验等血清学诊断技术。 内容及方法 当根据临诊和流行病学诊断为口蹄疫后，应进一步确定病毒的型，因为疫苗及血清的正确使用有赖于定型。病毒型鉴定的方法有以下几种。 口蹄疫病毒感染相关抗原琼脂免疫扩散试验 本方法用于检测被检动物血清中是否含有口蹄疫病毒感染相关(VIA)抗体(口蹄疫多型抗体)，以证实被检动物是否感染过口蹄疫病毒。本试验适用于易感动物的检疫、疫情监测和流行病学调查。 (一)材料准备 1．Tris一盐酸缓冲液 Tris 2.42g Nacl 3.8 g NaN3 0.2g 无离子水加至100ml，用HCl调pH至7.6。 2．器材 平皿(直径5.5 cm)、吸管、金属打孔器外径4mm、模板，在有机玻璃板上按以下规格打孔，一个中心孔和6个外周孔，所有孔的直径为4mm，中心孔边缘到外周孔的距离均为4mm。 3．VIA抗原 见使用说明书。 4．标准阳性血清．用A或O型口蹄疫病毒高免兔血清。 5．微量流射器或盐水接头若干及乳胶头。 6．印相暗盒或台灯(供观察沉淀线用)。 (二)操作方法 1．被检血清和阳性血清均以56℃灭能30min。 2．琼脂糖平板的制备 取琼脂糖1g，Tris—盐酸缓冲液100ml，装入三角瓶中，于沸水中加热或高压，将琼脂糖彻底融化。然后吸取7ml琼脂液加到平皿里，制成3mm厚的琼脂板。待琼脂完全凝固后，加盖置于湿盒中，贮藏在4℃冰箱中备用。 3．打孔 将模板放在琼脂板上，用打孔器通过模板的孔在琼脂板上打孔，并挑出孔中的琼脂块。 4．加样 按图9方式加样，即中心孔加VIA抗原，1和4孔加FMD阳性高免兔血清，2、3、5、6孔加被检血清。 5．扩散 将加样的琼脂平皿置于湿盒里于室温(20～22℃)任其自然扩散。 6．观察 于24h进行第一次观察，72h作第二次观察，168h作最后观察。观察时，可借助灯光或自然光源，特别是弱反应须借助于强光源才能看清沉淀线。 (三)结果判定 当1和4孔标准阳性血清与抗原中心孔之间形成沉淀线时，若被检血清孔与中心孔之间也出现沉淀线，并与阳性沉淀线末端相融合，则被检血清判为阳性。被检血清孔与中心孔之间虽不出现沉淀线，但阳性沉淀线的末端向内弯向被检血清孔，则被检血清判为弱阳性。如被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线，且阳性沉淀线直向被检血清孔，则被检血清判为阴性。如图9所示，2孔被检血清为阳性，5孔被检血清为弱阳性，3、6孔被检血清为阴性。 图9 口蹄疫琼脂扩散试验 二、反向间接红细胞凝集试验 1．病料处理 用pH7.2，0.1lmol／L磷酸缓冲液(或生理盐水)洗2—3次，并用消毒滤纸吸去水分。 (2)称重，加少许玻璃砂研磨，制成1：3悬液，室温浸毒1h或4℃冰箱中过夜。 (3)3000～4000r／min，离心20min，收集上清液。 (4)58℃水浴箱灭能40min(或不灭能)。 (5)3000～4000r／min，离心20min，收集上清即为被检抗原，置4℃冰箱中备用。 2．被检抗原的稀释 试管架上摆上一排试管8只，自第1管开始由左至右用稀释液进行倍比稀释(即1；6，1：12，1：24……1：768)，每管体积0.5ml。 3. 滴加被检抗原 取有机玻璃反应板，在第1至第4排每排的第8孔滴加第8管稀释抗原2滴，每排的第7孔滴加第7管稀释抗原2滴，以此类推至第1孔，每排的第9孔滴加稀释液2滴，作为阴性对照，每排的第10孔按顺序分别滴加A、O、C、Asia四种标准抗原(1：30稀释)各2滴，作为阳性对照(注意每型换滴管1只)。 4．滴加红细胞诊断液 用前将红细胞诊断液摇匀，于反应板第1至第4排孔分别滴加A、O、C、Asia型红细胞诊断液1滴。轻轻振摇反应板，使红细胞均匀分布。室温放置1．5～2h后判定结果。 5．结果判定． (1)判定标准 按以下标准判定红细胞凝集程度： ++++——完全凝集 +++——75％凝集 ++——50％凝集 +——25％凝集 一——不凝集 (2)观察反应板上各排孔的凝集图形。假如只1排孔凝集，且阴性对照孔不凝集(阴性)，阳性对照孔凝集(阳性)，其余3排孔不凝集，则证明此种凝集是与A型红细胞诊断液同型病毒所致的特异性凝集，被检抗原即判为A型，若只第二排孔凝集，其余3排孔不凝集，则被检抗原