家畜传染病学实验指导：副结核病的实验室诊断.docVIP

实验二十一 副结核病的实验室诊断 目 的 熟悉和掌握副结核病的细菌学、变态反应和补体结合反应诊断的操作方法。 内 容 及 方 法 细菌学诊断 细菌学诊断包括细菌镜检和细菌培养两种方法，其中有一种是阳性时，即可判为病畜。 病料采集 1．粪便 选取混有粘液、血液、粘膜等粪便，盛于小瓶中送检，也可从病畜直肠深部(约30cm)，用刮匙取少量粘液粪便。也可将上述材料直接制成涂片数张，自然干燥，用防水纸包扎送检。 2．肠及肠淋巴结 选取明显病变肠段，用自来水冲去肠内粪便，并采取病肠邻近相应的肠淋巴结和回盲瓣，盛于塑料袋中，冻结后送检。需作病理组织学检查时，可将肠及淋巴结浸泡于10％福尔马林溶液中送检。 (二)细菌镜检 取适量粪便(混有粘液、血液)加4～5倍蒸馏水，充分混匀，用4层纱布过滤，将滤液用5 000r／min离心30min，取沉淀制作涂片2—4张，用萋—尼氏抗酸染色法染色、镜检。直肠刮取物或粪中粘液、血液，可直接制成涂片，火焰固定，萋—尼氏抗酸染色后镜检。 副结核杆菌在显微镜下呈红色球杆状，成丛成团存在，背景呈蓝色。 (三)细菌培养 取粪便1～2g，加人生理盐水40ml充分混匀，用4层纱布过滤，滤液中加等体积的含有10％草酸和0.02％孔雀绿水溶液，混匀，放人37℃水浴中30min，3 500～5 000r／min离心30min，弃上清，将沉淀物接种到马铃薯汤培养基上，置37℃温箱培养。同时制一涂片镜检。 如被检病料为病肠段，则将肠剪开；用自来水轻轻冲洗肠内容物，将肠管在玻璃板上摊开，使粘膜面向上，用载玻片或外科刀刮取粘膜约l0～20g，置于灭菌的带有铜纱网的乳钵中研磨，边研磨边添加0.5％胰酶水溶液40mi使呈悬液，用1N氢氧化钠调pH至9.0，放在烧杯中，在磁力搅拌器上于室温搅拌lh，再以5 000r／min离心30min，弃上清，沉淀物重新悬浮于20mi灭菌生理盐水中，加入等量的含有10％草酸和0.02％孔雀绿水溶液充分混匀，37℃水浴30min，并不断振摇，再用5 000r／min离心30min，弃上清，取沉淀物接种于马铃薯汤培养基上，放人37℃培养。同时制一涂片镜检。 如被检病料为肠淋巴结，各称取10～20g，剔除外面脂肪后剪碎，放在灭菌的带有铜纱网的乳钵中研磨，以后的操作与病肠段者相同。每份病料接种3～5管培养基，第二天将露在试管外的棉塞剪去，用蜡封管口，37℃培养，一般经1～2个月出现肉眼可见的、针尖大的、灰黄色隆起的、不透明、边缘不甚整齐的细小菌落，镜检可见到细小抗酸杆菌。未长出菌落的培养管，须培养到6个月，若仍未见生长，方可弃去。 分离出的细菌培养物，分别接种1管加有分枝杆菌素和1管不加分枝杆菌素的改良Dubos培养基上，在37℃培养20～30天后，若是副结核杆菌，则在加人分枝杆菌素的培养基上生长，而在不加分枝杆菌素的培养基上不生长。马铃薯汤培养基的制备方法如下：取红皮马铃薯，洗净去皮，切成小方块， 按1：50加入蒸馏水，煮30min，补足水分，纱布过滤后，将制成的马铃薯汤置4~C冰箱备用。取天门冬素1g，KHzP041S，MgS04·7H20 0.05g，柠檬酸铁0.12g，甘油6ml，吐温—80 1.5ml，草分枝菌素0.1s(放人10ml无水酒精加温溶解)，加入100ml马铃薯汤中，放入水浴中加热溶解，冷至56℃时，加入卵黄200ml，2％孔雀绿液4ml，充分搅匀，纱布过滤，分装试管，80～85℃灭菌1h，隔一天再灭菌一次，置4℃冰箱备用。改良Dubos培养基的制备方法如下：取胰蛋白胨25g，天门冬素0.3g，无水NazHP04 2.5g，KHzP04 1g，柠檬酸铁铵0.05g，MgS04·7H20 0.6g，甘油25ml，吐温—80溶液50ml，琼脂15g，逐一加入蒸馏水中，轻轻加热，令其溶解，加蒸馏水至800ml，115．5℃灭菌15min，pH7.2，此即为基础培养基，置4～6℃保存备用。使用时，将基础培养基溶化，冷至56℃，加入草分枝菌素20ml，青霉素10万单位，氯霉素0.05g，放线酮0.1g，无菌牛血清200ml，充分混匀，分装试管，摆成斜面，令其凝固。 变态反应诊断 (一)药品器材 提纯副结核菌素或禽型提纯结核菌素；游标卡尺；注射器等。 (二)注射部位和术前处理 在牛颈左侧中部上1／3上，剪毛约10～15em(在与牛型提 纯结核菌素同时注射时，则在同侧颈中部距离提纯副结核菌素注射部位下方20cm处注射牛型提纯结核菌素)。用游标卡尺测量皮肤厚度。若该部位有硬结、创伤或化脓时，应另选部位或在对侧进行。羊在尾根皱褶部注射，亦可在颈部注射。 (三)注射剂量和方法