家畜传染病学实验指导：羊魏氏梭菌肠毒素的分离和鉴定.docVIP

实验二十五 羊魏氏梭菌肠毒素的分离和鉴定 目 的 初步掌握羊魏氏梭菌肠毒素的分离和鉴定技术。 内容及方法 魏氏梭菌毒素的种类 魏氏梭菌各型菌产生的毒素有α、β、γ、δ、ε、η、θ、ι、κ、λ、μ、ν、等共12种。在家畜传染病学中有重要性者为α、β、ε、ι四种。在实践中常见的A、B、C、D、E五种型菌中，α、β、ε、ι毒素的分布模式如图13所示。 因此，以A、B、C、D、E五种型菌之抗毒素与A、B、C、D、E五种型菌之毒素进行中和试验时，其中和情形如表23所示。 表23 各种魏氏梭菌毒素、抗毒素中和情形 抗 毒 素 中和的菌型 中和的毒素 A型 B型 C型 D捌 E型 A型 A、B、C、D型 A、C型 A、D型 A、E型 α α、β、ε α、β α、ε α、ι 二、魏氏梭菌肠毒素的分离和鉴定方法 1．毒素检查 羊只死后，尽快取小肠内容物(最好是回肠内容物)，加1％量的氯仿防腐，在冷藏条件下送检。实验室在收到送检材料后，用生理盐水稀释2～4倍，(若内容物稀薄，不必稀释)，充分混合后经离心沉淀(3 000r／min)15min，取上清液，用赛氏滤器过滤后，分为两份，一份直接注射动物(两只)，另一份加1％的胰蛋白酶粉，在室温处理1h以致活ε和ι毒素，破坏β毒素，然后注射另一组动物(两只)。如无离心机和赛氏滤器，可用滤纸反复过滤，直到滤液清朗即可。动物可用小鼠(静脉注射0.2—0.4m1)或家兔(静脉注射2～4m1)。注射后至少观察24h，根据两组动物的反应情况作出判断。如有肠毒素存在，动物一般于4～6h内死亡。如肠毒素含量高，动物可于10min内死亡；如肠毒素含量低，动物也可能于注射后一定时间内呈轻度昏迷，呼吸快速，经1h左右可能恢复。，正常绵羊肠道内容物注射后不弓I起反应。 也可用豚鼠进行毒素检查。方法为皮内注射上述待检滤液0.2～0.4ml，观察48h，如有毒素存在，注射部可见坏死变化。 2．中和试验 如证明病羊肠内容物里有肠毒素存在，究系哪一型菌的毒素，需用魏氏 梭菌定型血清(抗毒素)作中和试验鉴定之。方法如下： (1)取灭菌试管9支，编为l、2、3、4、5、6、7、8、9号，然后按表24所列，分别加入含毒素滤液、抗毒素和生理盐水，每管总量为0.8ml。混合后将9个管同时放置37℃温箱中，中和40min。 表24 魏氏梭菌毒素中和试验术式之一* 肠内容物滤液 抗 毒 素 管 号 未用胰蛋 白酶处理 用胰蛋 白酶处理 A型 C型 D型 E型 生理盐水 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0．5 0．5 O．5 0．5 0。5 0．5 0．5 0．5 0．5 0．1 0．1 0．1 0．1 0．1 0．1 0．1 0．1 0．1 0．1 0．1 0．1 O．1 O．1 0．3 0．2 0．1 0．3 0．2 0．1 0．1 (2)小鼠18只，分为9组，每组2只。各组依次注射上述9个管中1个管中的混合液， 注射剂量每鼠均为0.3ml。观察72h，按表25作出判断。 魏氏梭菌毒素中和试验，也可用小鼠按表26所列方法进行，观察72h，用第5管混合物注射的小鼠应全部死亡，其余可按表26和表27作出判断。 表25 魏氏梭菌毒素中和试验的各种反应结果之一 （据Carter，1973） 被 检 肠 毒 素 的 型 A B C D E 肠 内未 容经 茎霉 液处 理 肠 内经 容胰 物酶， 滤处十 液理 生理盐水 A型抗毒素 A型、C型抗霉索 A型、C型、D型抗毒素 生理盐水 A型抗毒素 A型、D型抗毒素 A刹、C型、D型抗毒索 、A型、E型抗毒素 - 动物 一动物 + - - _ 土 - - - _ + + -+* - + + -+* - + + + - - -+** -+** -+** - -+** +- -+* -+* - + + - - + + 土 士 土 + + + + - ＋：试验动物死亡 －：试验动物活存 *：因ε毒素处于原毒素状态，故常为一； *：因β毒素被胰酶破坏，故常为一； 表26 魏氏梭菌毒素中和试验术式之二* 管 号 肠内容物滤液 抗毒素(毫升) 生理盐水 中和 静脉注射小鼠 (毫升) U型 C型 n型 E型 (毫升) 数量 剂量(毫升／只) 1 2 3 4 5 0．9 0．9 0．9 0．9 0．9 0．3 0．3 0．3 0．3