捻转血矛线虫hc-daf-22 基因的原核表达及重组蛋白酶 - 中国农业科学.pdf

中国农业科学 2017,50(8):1535-1542 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.017 捻转血矛线虫Hc-daf-22基因的原核表达及 重组蛋白酶活性测定 1 1 1 1 1 1 2 1 郑秀平 ，丁豪杰 ，郭筱璐 ，杨怡 ，黄艳 ，陈学秋 ，周前进 ，杜爱芳 1 2 （浙江大学动物科学学院/浙江省动物预防医学重点实验室，杭州 310058 ； 宁波大学生物技术系，浙江宁波 315211 ） 摘要：【目的】捻转血矛线虫( Haemonchus contortus)是反刍动物主要的胃肠道线虫之一，该病在中国呈全 国性流行。为研究捻转血矛线虫（Haemonchus contortus ）脂肪酸代谢相关蛋白 DAF-22 的生化特性，对其基因 进行了克隆、原核表达，并对重组蛋白进行了体外酶活性测定。以期了解捻转血矛线虫 Hc-DAF-22 蛋白在过氧 化物酶体脂肪酸 β氧化中的作用。【方法】根据 NCBI 公布的H. contortus ZJ 株 daf-22 cDNA 序列（GenBank： HQ738470.1）设计特异性引物，克隆 Hc-daf-22 基因并构建重组质粒 pET-22b-Hc-daf-22， 经测序鉴定正确后 将其转化 -1 E. coli BL21，经终浓度为 0.1 m mol·L IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)诱导表达 4h，离心 菌液，50 mmol·L-1 浓度的 PBS 溶液重悬菌体溶液，冰浴超声破碎后上清沉淀分别进行 SDS分析。超声破碎 后产物以镍柱亲和色谱法分离纯化重组蛋白 Hc-DAF-22，并用 SDS检测蛋白纯化情况及以抗 His 血清作为 一抗 Western Blot 鉴定。纯化后蛋白用超滤管浓缩除去盐分，并按照蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定。 利用天然状态下的乙酰乙酰 CoA（AcAc-CoA）分子会发生酮-烯醇互变形成烯醇化合物特性，酶活试验以乙酰乙 酰辅酶 a 为底物建立标准曲线。硫解酶体外测活体系为（50 mmol·L-1 -1 -1 Tris-Cl pH 8.1，20 mmol·L MgCl ，60 μmol·L 2 CoA，10 μmol·L-1 AcAc-CoA，加入约 0.1 μg 蛋白），通过记录反应过程中由于底物（AcAc-CoA）的减少而引起 303 nm 波长下的吸收值的变化，从而计算出硫解反应的初始反应速率，最终确定复性后的 Hc-DAF-22 的硫解酶 活性。在相同条件下，取 AcAc-CoA 底物浓度为 10μmol·L-1 -1 -1 的反应体系（50 mmol·L Tris-Cl pH 8.1，20 mmol·L MgCl