哺乳动物胚之玻璃化冷冻保存 - 中国畜牧学会.pdf

中國畜牧學會會誌，40(1) ：1～17, 2011 哺乳動物胚之玻璃化冷凍保存 孫榮卿(1) 李坤雄(2)(3) 朱志成(1)(3)(4) 哺乳動物胚或卵之冷凍保存方法主要包含慢速冷凍法（slow freezing ） 與玻璃化冷凍法（vitrification ）兩種，其中玻璃化冷凍法為近年來冷凍技術主 要之發展方向。目前已研發之玻璃化冷凍技術，例如：開放式熱拉麥管 （open-pulled straw, OPS ）、冷凍環（cryoloop ）、冷凍板（cryotop ）、微滴冷凍法 （microdrop ）或金屬網（metal mesh ）冷凍法等，皆以減少冷凍保護液體積與 提高冷凍速率為目標，或輔以其它提升胚或卵低溫耐受性（cryotolerance ）之處 理，例如：去脂（delipation ）、高滲透壓差（high osmotic stress ），或於冷凍液 及培養液中添加抗氧化劑等。許多哺乳動物之胚或卵已證實可利用各種玻璃化 冷凍載具（carrier or devices ）成功冷凍保存，並於解凍後取得良好之體外及體 內發育結果，且可成功產下健康之後裔。本文針對各種玻璃化冷凍法之特性與 各種提升哺乳動物胚或卵抗凍性之處理加以探討。 （關鍵語：耐凍性、去脂、胚、卵、玻璃化冷凍） 哺乳動物胚之冷凍保存為現今生殖科技重要之一環，冷凍保存技術與胚移置（embryo transfer ） 技術結合，不僅使胚移置不受空間和時間的限制，並可選擇較佳之受孕母體以提昇懷孕率；此外， 冷凍保存技術之完善更可促進國際間優良種原之流通，促進畜牧產業之發展。哺乳動物胚之冷凍保 存首由Whittingham 等人所發明之慢速冷凍法（slow freezing ）成功，小鼠的胚經由冷凍保存、解 凍與胚移置後產下後代（Whittingham et al., 1972 ）。Rall and Fahy （1985 ）發明了玻璃化冷凍 （vitrification ）技術，並成功地冷凍保存小鼠8-細胞期胚後，許多研究轉而進行該技術之改善。因 此，近年來的進展十分迅速，開發出許多新的方法可提高冷凍效率，也促使玻璃化冷凍技術逐漸取 代慢速冷凍法，並廣泛地應用於實際胚與動物之生產上。 胚冷凍過程中之損傷主要來自細胞冰晶（ice crystal ）之形成、溶液效應（solution effect ）以及 (1) 國立中興大學動物科學系，40227 台中市國光路250 號。 (2) 台灣動物科技研究所生物科技組，35053 苗栗縣竹南鎮頂埔里科東二路52 號。 (3) 通訊作者，E-mail: khlee@mail.atit.org.tw ；jcju@dragon.nchu.edu.tw (4) 國立中興大學農業生物科技中心。 2 中國畜牧學會會誌 第 40 卷 第 1 期 滲透壓緊迫（osmotic shock ），此對胚於解凍後之復原及其後續發育造成極大不良影響。為謀降低 上述不利因子之影響，可藉由減少冷凍液體積、載具（carrier or devices ）型式、改變胚細胞表面積 與冷凍液體積之比例以增加降溫與回溫速率，或是以各種添加劑來提昇胚對冷凍之耐受性。目前哺 乳動物胚冷凍方法大致可區分為下列兩種：慢速冷凍法與玻璃化冷凍法兩種，茲分別說明如下： slow freezing Whittingham 等人第一例以慢速冷凍法成功冷凍小鼠胚。其冷凍方法是將小鼠胚置於含 1.0 M 的雙甲基氧化硫（dimethyl sulfoxide, DMSO ）冷凍液中，緩慢降溫平衡，在4℃植冰（seeding ）後， 先以慢速率降溫（0.33~1.0℃/min ）到-80℃，再置入液態氮（LN2 ）中長期保存。冷凍保存之樣品 以穩定、緩慢速率解凍（-25℃/min ），在等滲透壓解凍溶液（isotonic thawing solution ）中將胚回收； 並將解凍後的胚移置至受胚母小鼠後，成功產出正常之後裔（Whittingham