共表达折叠调节因子对尿激酶功能性表达的影响.doc

共表达折叠调节因子对尿激酶功能性表达的影响 白光兴，孙志伟2，俞炜源2，李 晋1 （1成都军区总医院急诊科，成都 610087，2军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071） 目的 研究共表达折叠调节因子对真核蛋白尿激酶UK（Urokinase）功能性表达的影响，改善大肠杆菌中UK表达产物的活性方法 通过分离分子伴侣DnaK，DnaJ，GroL-S及二硫键异构酶DsbA，DsbC基因，构建折叠调节因子表达载体，与UK表达载体双质粒共转化同一个菌株，观察共表达与单独表达时UK的表达产物活性变化 结果 共表达分子伴侣DnaK，GroEL-S，和二硫键异构酶DsbC，DsbA对UK表达产物的活性有明显的提高，最高的是GroEL-S。关键词：共表达；分子伴侣；二硫键异构酶；尿激酶活性 The Effects on yield of active UK with co-expression of protein folding modulators in E.coli BAI guang-xing1, SUN zhi-wei2, YU wei-yuan2 (1Chengdu Army Commend General Hospital, Chengdu 610083, Beijing Institute of Biotechnology, Beijing 100071, China) Abstract: Objective In order to study the effects of such chaperones and Dsb molecules on the yield of active urokinase. Methods The genes of DnaK, DnaJ GroEL , GroES, the signal sequenceless DsbA and DsbC were isolated from the chromosome of E.coli by PCR. The genes mentioned above were cloned into plasmids under the control of araB promoter and were transformed into E.coli BW25113 and HB101 together with a compatible vector for UK. The activity of UK was analyzed by fibrinolysis assay. Results The yield of active UK increased by co-expressing with DnaK, GroEL-S, DsbA, DsbC and their mutants in BW25113. The highest level of active urokinase was achieved by co-expressing with GroEL-S in both strains. Conclusion The yield of active UK increase in E.coli by co-expressing chaperones and disulfide isomerase. Key words: co-expression; chaperones; disulfide isomerase; active UK 大肠杆菌在基因工程的研究中应用极为广泛，然而在表达外源蛋白时常遇到的问题是表达产物不能正确折叠，以没有功能活性的包涵体形式存在，而包涵体的体外复性是一个困难而复杂的过程。因此提高外源蛋白在大肠杆菌中的功能性表达有很现实意义。低分子量尿激酶UK（Urokinase）共有6对二硫键，是二硫键比较多的蛋白在大肠杆菌中的表达产物没有活性。外源蛋白在大肠杆菌中的正确折叠需要分子伴侣的协助才能正确折叠而成为有功能的蛋白，这其中主要有类折叠调节因子对蛋白折叠有重要的影响，第类是分子伴侣，如DnaK，DnaJ，GroEL-GroES[]等；第类是二硫键异构酶Dsb系列分子。，本研究拟从大肠杆菌基因组上分离分子伴侣基因，以及二硫键氧化酶DsbA和二硫键异构酶DsbC两个基因，构建DsbA和DsbC的突变体基因，克隆到表达载体上，这些分子伴侣和Dsb家族分子在胞质中与UK双质粒转化，分别诱导表达，观察它们对UK功能性表达的影响，寻找对UK功能性表达有促进作用的分子，以改善在大肠杆菌中的功能性表达。BW25113本所王恒樑副研究员惠赠。HB101pQE-60购自Taraka生物有限公司。pBAD-Δssds