酶切粘红酵母基因组提取-李红红.docxVIP

酶切反应所需试剂试剂保存限制性内切酶-20摄氏度相应的buffer-20摄氏度无菌水室温酶的选择主要针对双酶切注意双酶切酶切效率，见书Takara 商品目录 A-7，主要是针对pUC18/19/118/119载体多克隆位点处限制酶双酶切效果，如果其它载体酶切位点排序与之相同，同样使用。尤其在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。注意同尾酶：BamH I/Bglll, Xho l/Sal l, Xba l/Nhe l/Spe l注意选择的酶在自己的基因中不含此酶切位点酶的星活性的问题:酶的星号活性问题也就是说，在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称星号活性。这种星号活性可能是内切酶的一种普遍特性，如果提供给相应反应条件，所有内切酶都会出现非特异性切割。NEB已证实以下酶存在星号活性：Apo I、Ase I、BamH I、BssH II、EcoR I、EcoR V、Hind III、Hinf I、Pst I、Pvu II、Sal I、Sca I、Taq I、Xmn I但是在正常操作条件下，酶一般不会出现星活性。注意以下几点:导致星号活性的因素： 1. 较高的甘油浓度（5% v/v）； 2. 酶与底物DNA比例过高（不同的酶情况不同，通常为100 U/μg）； 3. 低盐浓度（25 mM） 4. 高pH值（pH 8.0） 5. 存在有机溶剂甲基化对限制酶活性的影响，参照图书：Takara 商品目录A-34.最好选择酶切效率高的酶，选择有共同buffer的酶，有的双酶切需要添加BSA.两种酶切的条件不同时，分别进行分步酶切，切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。酶切体系单酶切：质粒载体：（载体量少、体积多、酶多但不能太多、时间长4-6h）试剂体积质粒20ul(亮的话10ul)10 x buffer5uldd H2O24ul限制性内切酶1ulUp to50ul目的基因：（片段多、体积多、酶少、时间：2-3h）试剂体积目的基因40ul10 x buffer5uldd H2O4ul限制性内切酶1ulUp to50ul质粒单酶切完后需进行去磷酸化操作！双酶切:质粒试剂体积质粒20ul(亮的话10ul)10 x buffer5uldd H2O23ul限制性内切酶11ul限制性内切酶21ulUp to50ul目的基因：试剂体积目的基因40ul10 x buffer5uldd H2O3ul限制性内切酶11ul限制性内切酶21ulUp to50ul1、酶切温度：一、37摄氏度恒温反应（具体温度参考酶的说明书），可在恒温培养箱或者PCR仪、水浴锅中进行，二、部分酶的反应温度为30℃或者其他温度2、酶切时间：与底物的量有关，基本原则是， PCR产物的酶切位点之前仅有3-4个保护碱基，所以限制性内切酶蛋白很难结合上，所以酶切的时间要加长，而质粒的酶切时间可以短些。一般酶切3个小时即可，必要时可过夜酶切，但是要注意防止核酸酶污染，过长时间导致DNA降解，注：NEB的酶为快速酶切。酶切位点保护碱基及酶切效率酶寡核苷酸序列切割率%2 hr20 hrAcc IGGTCGACCCGGTCGACCGCCGGTCGACCGG000000Afl IIICACATGTGCCACATGTGGCCCACATGTGGG0909009090Asc IGGCGCGCCAGGCGCGCCTTTGGCGCGCCAA909090909090Ava ICCCCGGGGCCCCCGGGGGTCCCCCGGGGGA509090909090BamH ICGGATCCGCGGGATCCCGCGCGGATCCGCG109090259090Bgl IICAGATCTGGAAGATCTTCGGAAGATCTTCC0752509090BssH IIGGCGCGCCAGGCGCGCCTTTGGCGCGCCAstE IIGGGT(A/T)ACCC010BstX IAACTGCAGAACCAATGCATTGGAAAACTGCAGCCAATGCATTGGAACTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT0252505090Cla ICATCGATGGATCGATCCCATCGATGGCCCATCGATGGG009050009050EcoR IGGAATTCCCGGAATTCCGCCGGAATTCCGG909090909090Hae IIIGGGGCCCCAGCGGCCGCTTTGCGGCCGCA