两株产海因酶菌株的分子生物学及理化性质的比较.pdfVIP

两株产海因酶菌椿的分子生物学爰理化性质的比较 摘要 D．型氨基酸广泛应用于医药、食品添加剂、杀虫剂及化妆品等行业。一般均采用生物 法或生物．化学法生产D，型氨基酸。D-型氨基酸及其衍生物的生物转化，经历两个反应历程， 首先是在海因酶的作用下，催化5’．单替代海因形成氨甲酰类氨基酸中间物，后者再在酶 或化学的作用下，生成相应的光学活性氨基酸或其衍生物。目前。用微生物菌体转化生产 D．型氨基酸的工艺路线已经产业化，但天然菌体转化工艺存在一些限制因素．阻碍了D．型 氨基酸的扩大生产，导致产品短缺。因此，科学工作者都在试图用工程菌替代天然菌生产 D．型氨基酸。 我们在克隆出发菌株SS-ori海因酶基因的过程中，偶然得到了一个能呈海因酶阳性反 应的菌落，定名为YZ-116，并做了较为细致的研究。结果表明，该菌株的遗传稳定性好， 连续传八代后海因酶活性仍无明显变化。而且在YCG培养基中，Amp浓度高达400ug／mL 时仍有菌落生长。同样条件下，SS-ofi菌在Amp浓度为50ug／mL时就不生长。分别提取的 基因组后进行酶切分析、海因酶基因的扩增、RAPD、ERIC-PCR等检测，两者均呈现不同 U／mL)， 的电泳图谱。菌株YZ．116的海因酶活性(0．72U／mL)高于出发菌株ss-甜(0．20 U／mL)。 U／mL)远远低于SS-ori菌(O．45 而N一氨甲酰基D．氨基酸酰氨水解酶活性(0．040 形态和生理生化特征也表明，ss．od菌周生鞭毛，革兰氏反应呈阴性，YZ-116菌为极生单根 ×(1．5-3．0)una个体稍大，氧化酶和过氧化氢酶试验均呈阳性。而且两者都是氧化产酸。 rDNA序 所以初步判定YZ．116菌为假单孢杆菌，而ss-ori菌为土壤农杆菌。最后通过16S 列扩增及分析说明YZ-116菌为Pseudomonas putia，SS-ori菌为Sinorhizobiumsp。我们还 利用PCR方法从菌株YZ．116基因组中克隆得到了海因酶的基因(1440bp)，并构建了表达 lmM)诱导，海因酶不但获得可溶性表达，而且酶活可达4．08U／mL，比原始菌株YZ-116 的海因酶活性提高了约6倍，最佳表达条件正在进一步实验中。 YZ．116菌具有较高的海因酶活性，但N．氨甲酰基雎氪基酸酰氨水解酶活性很低，仍不 适合用于D一型氨基酸生产工艺中的一步法转化。另一方面，含海因酶基因的人工菌株不但 酶活性高，也排除了天然菌株转化生产D一型氨基酸过程中的一些副产物。因此，用来制备 D-型氮基酸生物转化过程中的中间产物N-氨甲酰基氨基酸是一个理想的选择。同时，本文 的一些结果为我们实现用工程菌生物转化D．型氮基酸提供了有价值的数据与材料。 关键词：D．型氨基酸生物转化菌株SS—ori菌株YZ一116海因酶 两株产海因酶菌株的分子生物学及理化性质的比较 Abstract D-aminoarc acids usedinseveral widely fieldssuchas additives． pharmaceutics．food andcosmeticsetc．D-aminoacidsare or pesticides usuallyproducedbyenzymatic method．InbioconversionofaD-aminoacidandits chemo—enzymatic