糖多孢红霉菌λC3-SRR突变体构建及其产物鉴定.pdfVIP

摘 要 糖多孢红霉菌九C孓SRR 突变体构建及其产物鉴定 摘要 随着抗生素的大量应用，越来越多的病原菌产生了耐药性。寻找对耐药病原 菌有活性的新型抗生素，已成为十分迫切的任务。红霉素为一类广谱大环内酯类 抗生素，在临床上也出现了许多耐药病原菌。为寻找对耐药菌具有活性的新红霉 素类抗生素药物，在对红霉素结构进行化学修饰的同时，也在积极探索通过基因 工程途径对红霉素结构进行改造。 日前在临床上使用的特利霉素(telithmmycin)为第三代红霉素，是使用化 学方法对红霉素结构进行修饰的酮内酯类抗生素。其结构上最大的特点是大环内 酯c一3位由原来的L一克拉定糖替换成了酮基。缺失了这个克拉定糖，酮内酯类能 更易在内酯环其他位置衍生，另外酮基能避免诱导出大环内酯一林可酰胺一链阳霉 素B(m∞mlide·IincosHmide—strcptograminB，MLsB)抗性，大大提高了酮内酯类 对某些红霉素耐药性菌株的抗菌活性。由于红霉索母核中的c．3位功能基团．0H 是由其聚酮合成酶(polyI【e删csyl曲聃e，PKS)模块6中的酮基还原酶 列，使KR6酶域失活来生街合成酮内酯类。 在糖多孢红霉麓ⅪM酶域的NADPH结合保守区域中有五个重要氨基酸 VsRRG，红霉菌聚酮合成酶模块3的砌鹇酶域可能就是因为没有这五个氨基酸 而缺乏还原酮基的功能。本文利用染色体同源重组方法，将糖多孢红霉菌染色体 上KR6酶域DNA序列中编码VsRRG中的sRR三个氨基酸的九个核苷酸敲除， 获得了可合成酮内酯类3．脱氧．3．羰基一红霉内酯B的糖多孢红霉菌突变体 地3一sRR，为下一步筛选有生物活性的酮内酯类抗生素奠定了基础。 以糖多孢红霉菌基因组DNA为模板，用重叠PcR技术扩增出敲除了sRR 三个氨基酸相应九核苷酸序列的ⅪM酶域DNA片段，并克隆到同源重组载体 霉菌圮3菌株中，筛选出质粒整合到红霉素合成基因位点的整合体地3．A、№3．B 和托3-c。将地3一A在无硫链丝菌肽(111io)的R3M斜面上生长至少两代，制 摘 要 备原生质体滁R3M平皿，拂出不能在禽确io的R3M斜面上生长、发酵液也无 抑黼稻草秆菌效应静菌株进行DhiA序列分析，获得了糖多孢红霉菌突变株 越3·SRR。Z曲specF曲璜谱分析，证实藩株托3-sRR合成了酮内酶类化合韧3． 聪氧一3一羰萋一红霉内酶B(DO粕)，至藏我常j通过定赢突变的方法，乖j糟染甑体 圆滚重缱技术，获襻了哥合成酮内黼类3．脱氯．3一羰基*红簿内酯B的糖多孢红霉 瞽突变俸磁3．S贰R。磁较糖多孢霞霉蔼突交俸淝3_sRR与糖多孢缎霉篱突变体 M的蔟谱图，发现完全敲狳KR6酶域静突变体酣质谱圈中存簌醐产物2一脱译基 。3．裁氧。3．羰基．经霉蠹蘸转聪去两个承分子漪35l，l施分子离子峰，丙本文构建 戆糖多獾红霉菌突变体XC3．sRR艨谱嚣中没有351．{m垃分子离子峰，谎明在避 免澍产物合艘方覆，定点敝狳K酗酶域渊A穿列中翡s襞R三个爨基羧对赢丸 核蛰酸敬糖多氇跬霉壤突变传愆3。S躲毖竞全敲除}0赫赫域渊A穿剿熬突变 体艇螫骞伐势。 l￡邸酶域DNA孝列中s赋三令氨基酸瓣痊丸攘蓑酸廖列觳除鳇怼3-s髓突 变体霹台成瓤内骚类DOEB，援明S艇匹个爨基酸是缳持l(R6戆域还原活性涨必 霰的。比对玲辑l擞6酶域与放线蔑紫裘l汊酶域及人、大肠杼藏和镪绿缎单掇蓥 的眷胱牲肽还原酶的氮基骥序列，证实SRR中的RR二个碱性氨基酸是KR6鹣域 孵NADPH的2’一磷酸结念位点。另外，xR6酶域具有很多sDR家族鲍缳守基廖， 其催化中心与复台型SDR的催化中心相同，本文推测KR6酶域属于复合型sDR。 关键词糖多孢红霉菌，浆酮合成酶，同源重组，酮内酯类，3·脱氡·3一羰基- 红霉内酯B II Abs虹骱t Theconstruction of。鼬幽甜唧口 a珏d 《删，露妒露托孓SRR撒联t爨牲t