任锐-博士论文-提交版全文定稿.doc

　分类号 密级 　U D C 编号 适 体 识 别 引 发 的 D N A 循 环 聚 合 放 大 生 物 传 感 器 研 究 南 京 工 业 大 学 适体识别引发的DNA循环聚合放大 生物传感器研究 任 锐 指导教师姓名 张书圣 （教授） 申请学位级别 博士学位 专业名称 生物化工 研究方向 生物化学分析 论文提交日期 2011年 5月 二〇一一年 五 月 Biosensors with Signal Amplification Using Cycles of DNA-related Processes Triggered by Aptamer Recognition Dissertation Submitted to Nanjing University of Technology in partial fulfillment of requirement for the degree of Doctor of Engineering By Rui Ren Supervisor: Prof. Shusheng Zhang May 2011 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南京工业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 日 期： 学位论文的使用声明 □1、南京工业大学、国家图书馆、中国科学技术信息研究所、万方数据电子出版社、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文并通过网络向社会提供信息服务。论文的公布（包括刊登）授权南京工业大学研究生部办理。（打钩生效） □2、本论文已经通过保密申请，请保留三年后按照第一项公开（打钩生效） □3、本论文已经通过校军工保密申请，不予公开（打钩生效） 研究生签名： 导师签名： 日 期： 日 期： 摘 要 本论文的工作中，基于丝网印刷电极以及基于磁珠悬浮液分散体系建立了一系列生物分析检测方法，其中最重要的是几种适体识别引发的DNA循环体系。本文着重研究了适体识别引发的DNA循环体系在分析方法的灵敏度和特异性方面起到的作用。 首先，构建了一种新型的丝网印刷电极，并表征了其电化学性能。利用离子液体和聚苯胺纳米管掺杂的导电油墨制造丝网印刷电极中的工作电极，并在电极表面覆盖壳聚糖、沉积纳米金以改善其电化学性能。使用自制的直径在40~60 nm聚苯胺纳米管，进行掺杂，并选择[C12mim][PF6]作为离子液体。考察了构建电极的各种最佳条件，确定聚苯胺纳米管最佳掺杂量为0.55％，[C12mim][PF6] 最佳掺杂量为7.5 %（以其在油墨中的含量计）,壳聚糖最佳覆盖率为0.4 mg·cm-2。通过循环伏安扫描和电化学交流阻抗谱测量，上述条件下的掺杂和修饰丝网印刷电极具有较好的导电性、可逆性和稳定性等性能。 其次，以掺杂丝网印刷电极为基础，构建了基于HRP催化H2O2氧化邻苯二胺的反应的DNA杂交传感器。考察了该传感器上对DNA进行检测的各项最佳条件。上述氧化反应的最佳缓冲液为醋酸-醋酸钠，缓冲液最佳pH值为5.0；电化学检测的最佳支持电解质为PBS缓冲液，支持电解质最佳pH值为7.2。在H2O2浓度为16 mM、OPD浓度为30 mM时，HRP催化OPD与双氧水反应的最佳时间为15 min。在此传感器上，借助HRP的催化放大，对DNA的检测能够达到8.2 × 10-17 M的检测限，线性范围为2.0 × 10-16 M到8.0 × 10-15 M，并且具有对错配DNA的选择性。 第三，基于建立的丝网印刷电极，设计了一种通过DNA链替换循环放大策略检测DNA、并结合细胞的适体识别间接检测细胞的传感器。这种传感器是以Ramos肿瘤细胞适体的循环聚合为基础的。待测的靶细胞可以从磁珠上附着的细胞适体探针中通过适体结合替换释放出“信使序列”，而信使序列则可以被结合在电极上的发卡探针杂交识别，并在Kl