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注：以下翻译仅供参考，最终使用者请以英文原文说明书为准！ D-荧光素体外操作手册 介绍 荧光素是一种常用的荧光素酶表达的活体成像生物发光报告子。以ATP 和Mg2+作为辅因 子，有氧条件下荧火虫荧光素酶与水溶性底物反应发出一种特有的黄绿色发射光，在 37℃ 活体内转换为红光。该反应通过消耗ATP 来指示是否存在能量或生命的存在。 由于萤火虫荧光素酶的超灵敏性，快速和易于使用的体系，在研究基因表达方面萤火虫荧 光素酶是最常用的报告基因之一。荧光素酶被用来监测细菌，培养细胞和转基因植物或动物 的启动子活性反应。荧光素酶是一个 61kDa 大小的蛋白，它的活性形式是单体，且不需要 其它的加工修饰。通过催化荧光素的氧化羧化作用，萤火虫荧光素酶会产生已知的生物发光 中最高效的反应之一。荧光素酶活性用来描述与启动子/增强子元件相联的基因调控。通过 优化，化学发光反应产生的光和调控元件的转录活性之间存在直接相关性。 对于体外报告系统荧光素酶活性的检测，此手册将提供一个简单的，经济可靠的方法。 生物发光反应 几个因素将会影响反应的灵敏度，包括温度，pH 或底物浓度。为得到最佳结果，在使用 之前我们建议用pH7.8 的缓冲液，并且所有试剂在室温下预热。为充分反应，我们建议在分 析缓冲液中加入过量的ATP 和Mg2+ 。 当荧光素加入到荧光素酶样品中，会看到瞬间闪光在0.3-0.5 秒内达到峰值强度。这光将 随着半衰期0.5-1.0 分钟左右很快消失。但是初始如果在分析 buffer 中加入辅酶A ，将能阻 止快速反应延长半衰期至2-5 分钟。如果在反应混合液中后加辅酶A ，将促进额外的，次级 发光（Fraga, 2008）。 在Gold Bio，我们建议用以Yuichi Oba, et al. (2003)为基础的荧光素酶分析buffers： -100mM Tris- HCl(pH7.8) -5mM MgCl2 -250 uM CoA -150 uM ATP(Fraga, 2008) -150 ug/ml d-Luciferin(启维益成) 一些研究者在分析buffer 中也加入其它成份，比如DTT 或EDTA(Steghans, 1998)。根据您 具体需要可以适当调整分析buffer。为得到最佳结果，根据您具体细胞我们建议先做一个动 力学曲线的初步测试。 产品具体信息 D-荧光素钾盐 4 ，5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt KC H N O S 11 7 2 3 2 分子量：318.42 g/mol D-荧光素钠盐 4 ，5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid sodium salt NaC H N O S .H O 11 7 2 3 2 2 分子量：320.32 g/mol 储存：-20℃避光保存。 材料  D-Luciferin salt for GoldBio Luciferin Stock Solution(GLSS) 荧光素钾盐（启维益成, G156410 ） 荧光素钠盐（启维益成,G156411 ）  GoldBio Luciferase Assay Buffer(TMCA) Tris-HCl, pH7.8 MgCl2 Coenzyme A(CoA)(hydrate) ATP(disodium salt hydrate) GLSS(GoldBio luciferin Stock Solution)  PBS(不含Ca2+或Mg2+)  细胞裂解buffer  荧光素酶（对照） GoldBio 荧光素储备液 （GLSS）的制备 1. 用分子生物学级水配成15mg/ml （100 ×）荧光素储备液 a. 为最佳结果，荧光素储备液最好现配现用，但如果分成小份储存在-80 ℃可最长保存 一个月。 2. 在荧光素酶荧光分析中荧光素底物的终浓度应该是：150ug/ml （471uM 荧光素钾