海洋生物学第三章-2.pdf

第三节 生物的分子和细胞水平检测 一、加合物测定 二、一般代谢酶的活性测定 三、解毒系统酶类诱导作用的检测 四、抗氧化防御系统检测 一、加合物测定 (一)DNA-加合物的测定  DNA-加合物是化学物经生物转化后的亲电活性产物与DNA链特异 位点上的共价结合物，加合物的位点多在N-7鸟嘌呤，O-6鸟嘌呤， N-1-或N-3-腺嘌呤。由于DNA的重要生物学意义，所以DNA-加合 物的研究近年来倍受重视。  DNA-加合物测定方法除各种色谱法外，主要有免疫法、荧光法和 32P-后标记法三大类。  1.免疫法  2.荧光法  3.32P-后标记法 一、加合物测定 (二)蛋白加合物  研究表明，各种蛋白质亦可作为大分子形成化学物质加合物，且 其量与特定化学物的接触程度有关。其中外周血蛋白(血红蛋白、 血清白蛋白)最引入注意。  血红蛋白(Hb)在一定程度上可以代替DNA用于检测加合物，虽然 化合物与Hb的加合并不具有致癌作用，但由于Hb也具有亲核中心， 可与亲电物质反应形成稳定的Hb-加合物，因而Hb-加合物可间接 反映连接于DNA的加合物。  动物实验中已发现有50多种化学物质可与Hb反应，致突变物及致 癌物均可与Hb连接。  Hb-加合物最常用的测定方法为色谱-质谱(GC-MS)法和免疫法检 测， 二、一般代谢酶的活性测定  (一)乙酰胆碱酯酶  乙酰胆碱酯酶(AChE)是生物中一种重要酶，也是一个很经典的 毒理指标。由于有机磷农药能抑制AChE 的活性，所以AChE可作 为有机磷农药污染的指标。  早在50年代，韦斯(Weiss)就提出对自然水环境中极低浓度的有 机磷杀虫剂可用鱼脑或无脊椎动物的AChE活性的抑制来检测。  指标：一般认为20%以上的AChE抑制表明暴露作用的存在， 50%以上的AChE抑制表明对生物的生存有危害。 二、一般代谢酶的活性测定  (一)乙酰胆碱酯酶测定AChE活性  AChE活性最常用的方法是比色法。  埃尔曼(Ellman)比色法——其原理是，由胆碱酯酶水解乙酰胆碱的硫醇 同类物而产生出硫醇，可与双二硫代硝基苯甲酸(DTNB)起反应，即生成 一种深黄色的结合物，于是可在412nm波长处进行测量；  另一种比色法是依据与未水解的乙酰胆碱底物形成一种棕色的异羟肟酸铁 的络合物的原理，于540nm波长处进行比色测定。  放射测量法，系采用乙酰-1-14C胆碱作为底物，而用计数器测量所释放出 的乙酸-1-14C的浓度，未水解的底物先用离子交换法加以除去，而后将放 射性乙酸进行计数测量。所有测量在30分钟内即告完成，其准确度为3%， 或者更高一些。除上述测定方法外，还可采用测压法，荧光法和电化学法 对AChE活性进行测定。 二、一般代谢酶的活性测定 (二)腺三磷酶  腺三磷酶(ATPase)是生物体内重要的酶，存在于 所有的细胞中。  作用：水解高能化合物ATP而释放出供生命活动 所用的能量；  ATPase活性按Matsumura等的方法进行。用钼 蓝法测定经酶水解释放的无机磷。酶活性用毫微 摩尔无机磷／毫克蛋白／小时(nmol P ／mg ／h) 表示。 。 三、解毒系统酶类诱导作用的检测 (一)混合功能氧化酶的诱导作用  混合功能氧化酶(MFO)催化的反应类型繁多，且底物特异 性不强，故有多种方法用于MFO测定，可分为直接法和代 谢法。  直接法是直接测定MFO的各组成成分，如细胞色素P-450 含量等；  代谢法是通过测定MFO催化反应中的底物消耗量或产物生 成量。由于使用单一方法进行MFO的评价不够全面和可靠， 因此，在毒理学中常采用多种检测分析方法，从不同角度 进行MFO作用的评定。 三、解毒系统酶类诱导作用的检测 (二)谷胱甘肽硫转移酶  谷胱甘肽硫转移酶(Glutathione-S-transferase，GST)的分 布十分广泛，如在哺乳动物、昆虫、鱼、水生无脊椎动物、 植物以及可能在细菌中均含有此酶。  在哺乳动物中，发现