体外诱导大鼠骨髓EPCs成内皮细胞的实验分析.pdfVIP

圭堂塞三堡型杰幽幽主裳堡鲨塞 燮 体外诱导大鼠骨髓EPCs成内皮细胞的实验研究 中文摘要 嚣裁缝建缌织_I程囊管豹肉皮秘子缨照主要来自予塑体浅表器黥内皮 细胞、肾周脂肪和大网膜脂肪的微血管内皮细胞搏。这贱来源的内皮细胞， 除造成薪戆组织镧伤静，成熟肉皮缨夔俸静踣莽过程孛秘憩老纯，增建麓力 下降，难以满足种子细胞数量的要求；细胞生物活性下降，不适于构建功能 究好的缀织器官。类似其位于细藏，置懿来源的EPCs(内皮褪缀麓)作为 种子细胞可避免免疫排斥反应和组织创伤，而且体外适当条件下诱导可大量 增殖，不翁老化，是内皮种子细胞的新的洙源。有研究在体外诱导扩增EPCs 聪，预树予脱细胞血管内腔，回槌体内嚣可保持长时间的通畅率。从组织工 程角度出发，一个高效能EPCs体外诱导体系不但具有较高的诱婵阳性率， 逐要能缝缚内皮纲魏表受秘最娃驰缨憝趱蕴能力，炊表型葶瑶数量上涛是擒建 组织工程皿管的需要。 【目的】本实验利用大鼠骨髓EPCs体井诱簿成内皮缩胞，并对其表型 和增殖能力进行检测，以评价该诱导体系的实际效能。 【方法】第一部分检测该诱导体系诱尊EPCs成内皮细胞的能力，并检 测箕表鍪。渖洗Wistar大鬣殴骨耨弪雷蛰髓整，越髓缨稳懑滚逶遭密度梯度 离心得到单核细胞；按诱导组和未诱导组分组培养骨髓单核细胞；P2细胞第 十天，诱簿组程未诱导缀细胞进行缩脆免疫荧光稔溺，分涮检测肉皮细胞标 获的骨髓单核细脆、诱导组细胞(P2)和米诱导组细胞(p2)的内皮细胞标 溅VEGFR-2、VE·cadherin和PECAM-l；Western Blot检测诱导组缨骢敬 终缯驻(p2)混会培养，疆察其三维生长炊态。 第_-2部分检测该诱导体系在培养EPCs成内皮细胞过程中，细胞表型变 化和增蘧规律。纲胞分离、纯化和培养同第一部分：诱导缀和未诱导组细胞 第l页 占塑釜三匿型盔塑卿主堂垡迨塞 ⑧ 培养至第六代，观察细胞形态变化：计数原代细胞克隆形成率：原代第10 天从每组细胞中各取三盘计数细胞集落数，求平均值；检测细胞增殖能力： 从第l代至第5代计算诱导组和未诱导组细胞增殖倍数；流式细胞仪分别检 析：组间资料进行，检验。 【结果】第一部分：细胞形态观察发现，诱导组原代细胞成小梭形，5-7 天时出现典型的线样结构，P2-P3细胞逐渐成内皮细胞典型的销路石样结构， 未诱导组细胞未见这两种典型结构；细胞免疫荧光发现，诱导组细胞有较强 达，未诱导组未见明显荧光；流式细胞仪检测显示三种标记(VEGFR-2、 代培养后，诱导组中阳性细胞量明显升高，均高于35％，而未诱导组阳性细 胞率明显低于诱导组(刀O．01)；Western VE—cadherin表达；三维培养状态下诱导组细胞集落在胶原内有发芽式分支， 未诱导组未见到该生长方式。 第二部分：细胞形态观察可见，诱导组P4后细胞失去典型铺路石样形 态，形态逐渐不规则，胞浆边缘不清晰，胞浆内出现暗颗粒：原代培养第10 导组和未诱导组细胞的增殖能力明显随代次增加逐渐下降，第l、2代，含 有生长因子诱导组比未诱导组细胞增殖能力强cpO．05)，第3代时两组细胞 增殖能力相似◇O．05)，第4、5代诱导组的细胞增殖能力弱于未诱导组 在第2代与第5代中的阳性率无明显差别(矿O．05)，说明随诱导代次增加， 内皮细胞的阳性率并没有明显升高。 【结论】本实验建立了一种高效能的以VEGF和bFGF为主要诱导因子 的诱导体系，其对骨髓EPCs成内皮细胞的诱导率达35％．40％；建立了一套 第2页 坐三墨型盟型塑逖堡奎 ⑧ 较完整的骨髓EPCs分离、纯化、诱导培养和表型检测的方法；通过诱导细 胞阳性率和增殖能力的比较，可初步认为本实验诱导体系在体外诱导骨髓 EPCs成内皮细胞过程中，第二代诱导细胞在内皮细胞阳性率、内皮细胞绝 对数量和增殖能力上最适于构建组