硫键重排.PDFVIP

应用MALDI-TOF TOF MS 高能和低能碰撞裂解技术研究二 硫键重排 摘 要：甲酸切除Ammodytoxins 蛋白，通过MALDI-TOF MS 分析发现酸处理过程会导致DTT 还原的肽段发生二硫键重排，比较低能PSD 碎裂模式和高能CID 模式，低能PSD 模式主要提 供a-、b-和y-型离子信息，高能CID 能够提高整个碎片离子的强度，并且通过d-和w-型离子 的信息提供侧链的相关结构信息，利用更加丰富的结构信息证明了酸处理Ammodytoxins 蛋白 过程中出现的二硫键重排现象。 关键词：MALDI-TOF-MS 二硫键分析 PSD CID 碰撞 Ammodytoxins （Atxs ）是长鼻蛇分泌的一种潜在的神经毒素。Atxs （A 、B 和C ）通过刺 激神经末稍乙酰胆碱的释放，从而抑制细胞分离引起细胞损伤、凋亡甚至死亡。Atxs 类毒素在 氨基酸组成上具有很高的同源性，在组成毒素蛋白的122 个氨基酸中有177 个氨基酸残基是相 同的。在Atxs 类毒素中，14 个半胱氨酸形成7 个二硫键，具体结构信息见图1。 图1 Ammodytoxins A、B 和C 的氨基酸序列和二硫键分布图 （红色表示氨基酸的不一致，绿色表示甲酸切除位点） 二硫键重排 甲酸处理Atxs 样品进行序列识别。经过甲酸切开样品后，通过水相和有机相ZipTip 纯化。 ZipTip 纯化得到的肽指纹图互不相同，但是又具有互补性（见图2 ）。将Atxs A 、B 和C 的序列 分析结果与理论值进行比对，能够发现序列覆盖度达到95.6% 。但是，利用这些结果对所有Atxs 单体进行清晰的识别是很困难的。通过特征肽段峰m/z 2851 可以对AtxB 进行识别，通过m/z 1181 可对AtxC 进行识别。但是，AtxA 相关的特征肽段m/z 2853 或者m/z 1214 分别在Atx C 和AtxB 中存在，无法利用特征肽段对AtxA 进行准确的识别。 54 图2 Atxs 甲酸切除多肽指纹谱图 （A ）采用水相ZipTip 纯化的片段；（B ）采用有机相ZipTip 纯化的片段 根据预测的结构，如果对天冬氨酸的羧基端进行切除，将获得信息更加丰富的肽指纹图谱。 在目前的图谱中，切除位点在天冬氨酸前或后获得的肽段峰度非常低。有趣的是，指纹图谱中 观察到含有偶数个半胱氨酸残基的肽段，质量数偏移2 Da 和4 Da 的多肽出现在肽谱中（见图 3 ）。 进一步的研究发现这个特征肽段是由于相邻的半胱氨酸残基发生重排导致的。尽管这种情 况很少发生，但是从键能的角度考虑是可能发生的，并且这种现象在其他毒素中也发现过。在 DTT 还原条件下进行酸水解是研究二硫键交换的有效手段，但是仅限于分子内的快速反应，但 是对于本次实验中发现的相邻半胱氨酸重排反应，并不具备这个反应条件。因为我们认为在Atxs 分析过程中，尽管DTT 浓度是足够还原7 个二硫键，但是在样品纯化或干燥过程中发生的氧化 可能会导致高反应活性的巯基或者DTT 降解。通过DTT 还原和IAA 烷基化处理蛋白，进一步 酸水解得到的多肽谱图，以这样的方式来验证分子内的二硫键的形成。获得的多肽指纹图谱中 并没有观察到含有偶数个半胱氨酸残基的多肽峰。 图3 由于氧化Atxs 肽段形成了质量数相差2 Da 或者4 Da 的质谱峰 55 利用高能和低能碰撞裂解对分子内形成的二硫键进行研究 利用MALDI TOF-TOF，采用PSD （低能碰撞）和CID 模式（高能碰撞）对Atxs 多肽 RCCFVHD 进行分子内氧化态和还原态二硫键研究，获得更加丰富的结构信息。 在低能碎裂过程中，RCCFVHD 的氧化态和还原态中都可以观察到a-，b-和y-型离子（见 图4 ）。并且a-和b-型离子相关的丢NH3 （17 Da）离子也出现在肽图中，这说明肽段的N 末端 含有精氨酸，由于精氨酸的直接裂解产生的特征肽段离子。同时，在a-和b-型离子中也能够观 察到由于氧化引起的丢失2 Da 质量数的肽段离子。