蛋白质磷酸化检测方法及原理.PDFVIP

134 中国医药生物技术 2013 年 4 月第 8 卷第 2 期 Chin Med Biotechnol, April 2013, Vol. 8, No. 2  DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.02.010 ·综述· 蛋白质磷酸化检测方法及原理 刘奇，尹磊淼，魏颖，王宇，徐玉东，冉君，杨永清 32 蛋白质是生命活动的物质基础，是机体细胞的重要组成 白所致的磷酸化基础水平相比， P 同位素放射性标记的突 部分。新生蛋白质多肽需要经过翻译后修饰才能转变为成熟 触磷酸化蛋白在 L- 甲状腺素（L-T3 ）作用下显著增多，使 蛋白质。翻译后修饰包括：甲基化、羟基化、羧基化、糖基 用乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA ）可以明显抑制甲状腺 化、脂酰化、异戊烯基化等共价修饰[1] 。蛋白质磷酸化是最 激素所致钙离子和钙调蛋白产生的磷酸化影响，提示高比例 重要的蛋白质翻译后修饰之一，在蛋白激酶催化作用下，磷 的 L-T3 所致成年大鼠大脑皮层突触蛋白磷酸化依赖钙及 酸基团由供体分子转移到蛋白质的含有羟基的氨基酸侧链 钙调蛋白的参与。El-Benna 和 Dang[8]分析了人中性粒细胞 上，具有可逆性[2] 。蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着生 内的蛋白磷酸化，应用 32P 同位素放射性标记，在刺激中 命活动的全部过程，文献显示在任何时间内真核细胞蛋白分 性粒细胞蛋白发生磷酸化之前给细胞内 ATP 加入 32P 同 子中约有 1/3 的数量在发生磷酸化[3] ，主要发生在丝氨酸、 位素放射性标签，激发磷酸化后从细胞中提取蛋白，经显影 苏氨酸和酪氨酸上，较少见的磷酸化氨基酸还有精氨酸、组 观察分析中性粒细胞蛋白的磷酸化。 氨酸、赖氨酸以及天冬氨酸和谷氨酸等。蛋白质磷酸化氨基 1.2 Western blot 蛋白免疫印迹 酸有 4 种类型：①氧-磷酸盐，通过羟氨基酸的磷酸化形成； 蛋白质磷酸化作用可以通过 Western blot 利用抗磷酸 ②氮-磷酸盐，通过精氨酸、赖氨酸或组氨酸的磷酸化形成； 化蛋白抗体进行检测。Western blot 特异性好、分辨率高， ③酰基磷酸盐，通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成；④ 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以一抗为探针，结合标记的二抗 [4] 硫-磷酸盐，通过半胱氨酸磷酸化形成 。 并以自显影或者底物显色来显示蛋白条带。凝胶由上层的浓 鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索 缩胶和下层的分离胶组成。蛋白样品经过浓缩胶和分离胶后 磷酸化修饰过程的奥秘及其对生命活动的影响已成为众多 会以清晰的印迹按分子量大小依次上下排列于胶面上，然后 生物化学家及蛋白组学家所关心的内容，用蛋白组学的理念 将蛋白转移至 PVDF 膜（聚偏氟乙烯膜）或 NC 膜（硝酸 和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞 纤维素膜），蛋白会以非共价键的形式稳固地结合在载体上， 或组织中磷酸化修饰状态及其变化，其中磷酸化修饰蛋白质 选择对应的磷酸化抗体，发生抗原抗体反应，再与酶或同位 的识别与检测是蛋白质组学研究的关键技术之一。 素标记的二抗起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电 泳分离的