多糖化学修饰方法.docVIP

主要试剂与仪器 试剂 吡啶-三氧化硫复合物 92.0% 梯希爱化成工业发展有限公司 吡啶 分析纯 西陇化工股份有限公司 改良型RPMI 1640培养基 细胞培养基 美国赛莫飞公司 高糖型DMEM培养基 细胞培养基 美国Mediatech Inc（中国）公司 优级胎牛血清 生化试剂 合肥博美生物科技有限责任公司 硫酸链霉素 生化试剂 合肥博美生物科技有限责任公司 青霉素钠 生化试剂 德国Ruibio公司 胰蛋白酶 生化试剂 天津市光复精细化工研究所 噻唑蓝（MTT） 生化试剂 德国Ruibio公司 三偏磷酸钠 分析纯 瑞士阿达玛斯试剂公司 三聚磷酸钠 分析纯 上海润捷化学试剂有限公司 碳酸氢钠 分析纯 上海振企化学试剂有限公司 三羟甲基氨基甲烷 生化试剂 上海源聚生物科技有限公司 钼酸铵 分析纯 上海振企化学试剂有限公司 抗坏血酸（VC） 分析纯 上海展云化工有限公司 浓硫酸（H2SO4） 分析纯 上海苏懿化学试剂有限公司 磷酸氢二钾（KH2PO4） 分析纯 汕头西陇化工厂有限公司 浓硝酸 分析纯 上海中试化工总公司 硫酸钾（K2SO4） 分析纯 汕头西陇化工厂有限公司 三氯乙酸 分析纯 天津市光复精细化工研究所 氯化钡 分析纯 广东省台山市众城化工有限公司 明胶 分析纯 合肥博美生物科技有限责任公司 焦性没食子酸（邻苯三酚） 分析纯 成都市科龙化工试剂厂 丙酮 分析纯 上海中试化工总公司 硫酸亚铁（FeSO4） 分析纯 天津市致远化学试剂有限公司 水杨酸 分析纯 天津市博迪化工有限公司 何云龙 P S修饰 LEP-2b衍生物的制备 参考孙雪等的方法[103]，将8.57 g三聚磷酸钠与1.43 g三偏磷酸钠混合后和5.0 g的硫酸钠溶解于100 mL双蒸水，之后加入1.0 g LEP-2b，用NaHCO3调pH至9.0，80 °C恒温水浴，5.0 h后加五倍体积的95%乙醇，静置24 h。离心，收集沉淀并复溶于水，对自来水、蒸馏水分别透析（截留分子量为13,000 Da，下同）2 d、1 d，过滤，冷冻干燥，即得磷酸酯化多糖PLEP-2b。 将90 mL吡啶加入附有冷凝管、温度计的250 mL三颈瓶中，用电磁加热搅拌器搅拌，同时缓慢加入三氧化硫-吡啶7.5 ~ 9.0 g。加热至90 °C，再加入LEP-2b粉末1.5 g，恒温搅拌1 h，冷却至室温。用3 mol·L-1的NaOH溶液调节反应液至中性，加入五倍体积的95%乙醇使多糖沉淀。静置24 h后离心，将沉淀复溶于水，分别对自来水和蒸馏水透析2 d、1 d，过滤，冷冻干燥，即得硫酸酯化多糖SLEP-2b。 LEP-2b衍生物中取代基的取代度的测定 PLEP-2b中磷酸基含量的测定[103] 磷酸基标准曲线绘制：称取3.6 g三羟甲基氨基甲烷（Tris）和120 mg MgCl2·6H2O溶解于300 mL双蒸水中，1 mol·L-1的HCl调pH=7，即得Tris缓冲溶液。分别取相同体积的20%的VC水溶液、3 mol·L-1的H2SO4溶液和3%的钼酸铵水溶液，混合均匀即得定磷试剂。准确称取1.0000 g KH2PO4溶于100.00 mL水中，将所得溶液稀释100倍，即得浓度为0.1 mg·mL-1的磷酸基标准液。准确吸取上述磷酸基标准液0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00 mL，分别移入比色管中，蒸馏水补充至5.00 mL，加入Tris缓冲溶液3 mL，摇匀后加入3 mL定磷试剂，45 °C恒温水浴30 min，之后在660 nm处测定吸光值，以磷酸根浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 磷酸基测定：采用钼蓝比色法，取0.1 g样品于烧杯中，加入1 mL浓硫酸和1 mL浓硝酸，加热至冒烟，冷却后加入1 mL 30%的H2O2溶液，再缓慢加热，重复以上步骤直至烧杯内不再冒烟，溶液呈无色透明或淡黄色。冷却，加入1 mL 6 mol·L-1的盐酸并加热使酸彻底分解，转移并定容至50 mL。取5 mL（含0.01 g多糖）上述溶液，按照上述标准曲线操作方法测定其吸光度，根据标准曲线回归方程计算磷酸基含量。 SLEP-2b硫酸基含量的测定 绘制硫酸根标准曲线：精密称取105 °C干燥至恒重的K2SO4 108.75 mg，以1 mol·L-1的HCl溶解，定容至100 mL容量瓶中，摇匀即得硫酸根标准贮备液（0.6 mg·mL-1）。准确吸取硫酸根标准贮备液0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mL，均以HCl溶液补至0.20 mL，同时以0.20 mL HCl溶液作为空白，加入3%三氯乙酸3.8 mL及氯化钡-明胶溶液（用0.5%明胶